長(zhǎng)期以來(lái)，鹿科動(dòng)物受到一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的侵襲，這種疾病對(duì)個(gè)體來(lái)說(shuō)致死率高達(dá)100%，并且具有群體效應(yīng)。這種疾病被稱為慢性消耗性疾病（CWD），是由錯(cuò)誤折疊的朊病毒蛋白引起的。該疾病可以通過(guò)接觸感染者的體液和組織或暴露于受污染的飲用水或食物等環(huán)境而傳播。目前，慢性消耗性疾病的診斷依賴于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）對(duì)鹿淋巴結(jié)的篩查和隨后的免疫組化（IHC）對(duì)ELISA陽(yáng)性結(jié)果的確認(rèn)。事實(shí)證明，這種疾病很難控制，部分原因是目前的檢測(cè)方案存在敏感性和特異性問(wèn)題。

據(jù)麥姆斯咨詢報(bào)道，近期，來(lái)自美國(guó)密蘇里-哥倫比亞大學(xué)（University of Missouri–Columbia）的研究人員開(kāi)發(fā)了一種準(zhǔn)確、快速和低成本的MEMS微流控生物傳感裝置，用于檢測(cè)咽后淋巴結(jié)（RLNs）中慢性消耗性疾病的病理性朊病毒。相關(guān)研究成果以“A microfluidic biosensor for the diagnosis of chronic wasting disease”為題，發(fā)表在Microsystems & Nanoengineering期刊上。

圖1 用于慢性消耗性疾病診斷的MEMS微流控生物傳感器

圖2 MEMS微流控生物傳感器的操作流程

該MEMS微流控生物傳感器的設(shè)計(jì)包括三種新穎的區(qū)域/功能，如圖1a所示。

首先，為了有效地聚集朊病毒蛋白，該研究開(kāi)發(fā)了一個(gè)專(zhuān)用區(qū)域。該區(qū)域的特點(diǎn)是兩組聚集電極以平行方式連接在單個(gè)水平的微流控通道中。每個(gè)電極組由電鍍金制成的厚斜坡?tīng)铍姌O，以及斜坡?tīng)钔ǖ纼?nèi)由鉻（Cr）/金（Au）薄膜制成的45°傾斜的指狀電極對(duì)組成。這種獨(dú)特的構(gòu)造產(chǎn)生了正介電泳（p-DEP）力，從而有效地將朊病毒抗原聚集在通道中心，并被引導(dǎo)流向檢測(cè)微通道。此外，超過(guò)原樣品培養(yǎng)基體積90%但不含朊病毒蛋白的大量流體向外通道流動(dòng)，并被引導(dǎo)到廢液排出口。

該微流控生物傳感器設(shè)計(jì)的獨(dú)特之處在于，利用斜坡?tīng)铍婂兇怪眰?cè)壁和傾斜的薄膜指狀電極，產(chǎn)生了強(qiáng)大的電場(chǎng)強(qiáng)度和梯度。這種梯度有效地將朊病毒抗原推向了電場(chǎng)強(qiáng)度和梯度最高的通道中心線，無(wú)論其在通道的橫向或者縱向上的位置如何。與缺乏聚集機(jī)制的阻抗型生物傳感器相比，通過(guò)引入該聚集區(qū)域，該生物傳感器顯著提高了對(duì)慢性消耗性疾病朊病毒蛋白的檢測(cè)靈敏度。

此外，該研究通過(guò)使用COMSOL進(jìn)行大量仿真，確定了最大化通道中心電場(chǎng)強(qiáng)度和梯度的最佳幾何形狀（圖3a）。總而言之，該優(yōu)化設(shè)計(jì)通過(guò)有效地將朊病毒蛋白聚集在通道中心并將其導(dǎo)向檢測(cè)區(qū)域，從而提高了檢測(cè)靈敏度。

圖3 電場(chǎng)建模與仿真

其次，為了進(jìn)一步提高慢性消耗性疾病朊病毒蛋白/抗原的濃度，在該MEMS微流控生物傳感器中引入了專(zhuān)門(mén)的捕獲區(qū)。該區(qū)域由環(huán)繞檢測(cè)電極區(qū)域的垂直電極對(duì)以及由電鍍金制成的垂直指狀電極組成。捕獲電極利用正介電泳力產(chǎn)生的高電場(chǎng)強(qiáng)度和梯度，足以有效地阻滯和捕獲檢測(cè)電極上表面的朊病毒抗原。這種捕獲電極設(shè)計(jì)確保了朊病毒抗原被捕獲，無(wú)論其在通道的橫向或縱向上的位置如何。

在抗原-抗體結(jié)合過(guò)程中，捕獲電極被激活10分鐘，為慢性消耗性疾病朊病毒抗原和固定化抗體之間的相互作用提供了充足的時(shí)間。與缺乏這種機(jī)制的基于阻抗的生物傳感器相比，通過(guò)引入這種專(zhuān)用捕獲區(qū)域，生物傳感器的靈敏度大大提高了。這種靈敏度的提高使得其在低濃度下能夠可靠地檢測(cè)慢性消耗性疾病朊病毒蛋白/抗原。此外，該研究利用COMSOL仿真進(jìn)一步優(yōu)化了捕獲電極的幾何形狀。

最后，為了最大限度地提高檢測(cè)靈敏度，研究人員在專(zhuān)用的朊病毒檢測(cè)區(qū)域使用了兩組叉指電極（IDE）陣列。其中一組電極陣列是專(zhuān)門(mén)為檢測(cè)目的而設(shè)計(jì)的，而另一組電極陣列作為陰性對(duì)照。該檢測(cè)區(qū)域位于寬度為50 μm的微流控通道內(nèi)，比聚集區(qū)域窄得多。此外，為了獲得最佳靈敏度，研究人員使用COMSOL對(duì)檢測(cè)電極的幾何形狀進(jìn)行了全面建模和仿真（圖3b）。

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)該MEMS微流控生物傳感器的特異性和選擇性，研究人員分別對(duì)非朊病毒抗原（藍(lán)舌病病毒（BTV）和流行性出血熱病毒（EHDV））進(jìn)行抗朊病毒單抗檢測(cè)，并對(duì)朊病毒抗原進(jìn)行抗牛冠狀病毒（BCV）抗體檢測(cè)。已知的咽后淋巴結(jié)陰性樣本和無(wú)抗原對(duì)照也包括在內(nèi)。此外，對(duì)蛋白酶K酶解后的咽后淋巴結(jié)樣品進(jìn)行檢測(cè)，以確認(rèn)是否檢測(cè)到致病性朊病毒。

結(jié)果顯示，該MEMS微流控生物傳感器可以在1:24的稀釋度下有效檢測(cè)到工程朊病毒抗原，而ELISA在1:8的稀釋度下能夠檢測(cè)到相同的抗原。該生物傳感器對(duì)強(qiáng)咽后淋巴結(jié)陽(yáng)性樣品的相對(duì)檢測(cè)限（rLOD）為1:1000稀釋?zhuān)鳨LISA的相對(duì)檢測(cè)限為1:100。因此，該生物傳感器的靈敏度是目前已批準(zhǔn)的慢性消耗性疾病診斷方法ELISA的10倍。

總而言之，該研究利用已知的咽后淋巴結(jié)陰性樣本、一種陰性對(duì)照抗體（牛冠狀病毒單克隆抗體）和兩種陰性對(duì)照抗原（藍(lán)舌病病毒和流行性出血熱病毒）證實(shí)了該微流控生物傳感器的特異性和選擇性，并且通過(guò)檢測(cè)蛋白酶消化陽(yáng)性咽后淋巴結(jié)樣品，驗(yàn)證了該MEMS微流控生物傳感器檢測(cè)致病性朊病毒的能力。

圖4 該MEMS微流控生物傳感器的特異性、選擇性和陰性對(duì)照研究

圖5 對(duì)該MEMS微流控生物傳感器檢測(cè)致病性朊病毒的能力進(jìn)行驗(yàn)證

審核編輯：劉清