腫瘤細胞間的交流對腫瘤的發(fā)生及發(fā)展具有重要意義。細胞外囊泡（EVs）是細胞分泌的納米或微米尺度的囊泡，通常根據(jù)其大小或形成/釋放途徑分為外泌體、微囊泡和凋亡小體等。近年來，研究證實EVs是細胞間重要的信號傳遞載體，EVs正在成為新興的有前景的癌癥診斷生物標(biāo)志物。2016年，日本科學(xué)家Yoshinori Ohsumi因揭示自噬機制而獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。該機制中，自噬被描述為一種分解代謝途徑。但最新研究表明，自噬小體可以從細胞內(nèi)降解途徑轉(zhuǎn)化為細胞外分泌途徑，形成另一種EV類型，即分泌型自噬小體。最近的研究表明，分泌型自噬小體與腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān)，揭示了分泌型自噬小體在腫瘤進展研究中的潛在作用。因此，更好地了解分泌型自噬小體內(nèi)部或表面的內(nèi)容物對實現(xiàn)癌癥診斷和探索其在癌癥進展中的作用具有重要意義。

近期，東南大學(xué)劉松琴教授課題組報道了一種三維微流控芯片，用于分泌型自噬小體的高效捕獲與表面蛋白靈敏檢測（圖1）。相關(guān)成果以“Three-Dimensional Microfluidic Chip for Efficient Capture of Secretory Autophagosomes and Sensitive Detection of Their Surface Proteins”為題發(fā)表在國際化學(xué)權(quán)威雜志Analytical Chemistry上。論文通訊作者為劉松琴教授，共同第一作者為青年教師華鑫及碩士生劉晰。

圖1 基于三維微流控芯片的分泌型自噬小體高效捕獲與表面蛋白檢測示意圖

研究人員構(gòu)建了一種具有紡錘形微柱陣列結(jié)構(gòu)和明膠逐層修飾的三維（3D）微流控芯片（圖2）。之前的研究表明，微柱陣列可以在流體通過微通道時產(chǎn)生各向異性流動，從而增加溶液中的反應(yīng)物與微通道表面之間的接觸概率。有限元模擬結(jié)果表明，微柱陣列中存在一個非對稱流分叉，這種各向異性流動可以增強相對較大的自噬小體在LC3B抗體修飾微通道表面的傳質(zhì)。流體流過陣列通道的時間越長，自噬小體與抗體發(fā)生反應(yīng)的機會就越大。此外，由于橫截面上速度分布不均勻?qū)е碌亩蜠ean流進一步增加了自噬小體與LC3B修飾微通道表面相互作用的概率。另外，通過多層生物素化明膠修飾，增加了捕獲抗體的固定位點。因此，3D芯片的自噬小體捕獲效率（74%）明顯高于未修飾的平板芯片（47%）。

圖2 （A）微流控芯片設(shè)計圖；（B）分布在芯片內(nèi)的梭狀微柱陣列的SEM圖像；（C-D）有限元模擬通道寬度方向上的流動模式（C）和通道長度方向上的橫向流動剖面圖（D）；（E-F）CLSM對涂有生物素化明膠薄膜和鏈霉親和素-FITC的芯片進行平面掃描（E）和3D掃描（F）圖像。

利用所制備的兩種抗體-量子點偶聯(lián)探針，該芯片采用兩步免疫反應(yīng)及熒光分析，成功捕獲并檢測了卵巢癌細胞分泌的自噬小體。結(jié)果表明，該芯片可對分泌型自噬小體表面的兩種蛋白LC3B和HSP60實現(xiàn)靈敏檢測，檢出限（LODs）分別為141粒子/μL和126粒子/μL。此外，自噬小體上LC3B和HSP60的表達均可用于區(qū)分癌癥患者和健康人群的血清樣本，其p值分別小于0.01（具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異）和0.05（具有統(tǒng)計學(xué)差異）。另外，LC3B與HSP60信號加和的p值小于0.001（具有極顯著的統(tǒng)計學(xué)差異），表明該芯片在癌癥診斷方面具有良好的應(yīng)用潛力（圖3）。

圖3（A）在PBS和健康人血清中添加自噬小體標(biāo)樣LC3B的檢測；（B）兩種細胞在相同體積的細胞培養(yǎng)上清中收集的自噬小體中LC3B和HSP60的表達；（C）卵巢癌患者臨床標(biāo)本與正常人自噬小體LC3B和HSP60表達比較；（D）卵巢癌患者和正常人的臨床樣本中自噬小體LC3B和HSP60信號的總和。（*p＜0.05，**p＜0.01和***p＜0.001）。

綜上所述，研究人員設(shè)計了一種用于分泌型自噬小體分離檢測的三維微流控芯片。芯片采用梭狀微陣列結(jié)構(gòu)和明膠層修飾，不僅增加了芯片內(nèi)部的表面積，也增加了流體和芯片之間的接觸時間和抗體的修飾位點，大大增強了自噬小體的捕獲效率。隨后，采用兩種抗體偶聯(lián)量子點探針，實現(xiàn)了芯片中多個自噬小體表面蛋白的同時檢測，靈敏度高、樣品消耗低。此外，對臨床血清樣本中的自噬小體檢測結(jié)果表明，該芯片在準(zhǔn)確區(qū)分癌癥患者和健康人群方面具有良好的可行性，這表明該策略在臨床癌癥診斷中具有良好的應(yīng)用前景。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c01419

編輯：黃飛