腫瘤基質，特別是細胞外基質(ECM)，是實體腫瘤的一個顯著特征，在腫瘤發展中起著至關重要的作用。許多促結締組織增生性腫瘤，包括乳腺癌，都涉及I型膠原的顯著積聚，并且I型膠原分子的分布和結構與其豐度在腫瘤中同等重要。此外，癌相關成纖維細胞（CAF）存在于乳腺癌組織中，通過重塑ECM發揮促腫瘤和抗腫瘤作用。

本文中，為了研究上述三者與乳腺癌發展的關系，研究者利用質譜技術檢測ECM中的蛋白質組，發現了在腫瘤中顯著上調的膠原蛋白XII，可調節I型膠原纖維，促進癌細胞侵襲和轉移，并結合單細胞轉錄組測序確認CAF是膠原蛋白XII的主要來源。

研究路線

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研究內容

腫瘤基質蛋白質組的動態變化

隨著實體腫瘤生長，ECM的持續重塑導致正常組織基質被腫瘤基質取代，這種重塑在腫瘤進展中起著重要作用。研究者使用自發且多發性腫瘤中期（PyMT）基因工程小鼠模型（GEMM），收集早期（增生期）、中期（腺瘤）和晚期（轉移性腺癌）的乳腺癌組織和相同年齡健康小鼠的乳腺脂肪墊組織，來研究乳腺癌發生過程中ECM隨時間的變化。

對組織進行脫細胞操作以富集ECM蛋白質，然后進行DIA質譜檢測蛋白質組，在脂肪墊和腫瘤中定量到150種基質蛋白，其中113種在腫瘤和健康脂肪墊中差異表達。這里面有71種屬于核心基質蛋白，42種與基質相關，包括分泌因子、ECM相關蛋白和ECM調節劑。

通過聚類分析發現了四個具有不同時間表達特征的離散clusters。C1中的蛋白質在健康組織中隨時間逐漸上調，但在腫瘤中表達更高，并隨腫瘤發展進一步增加。C2中的蛋白質在腫瘤三個階段與健康脂肪墊相比均上調，C3中蛋白質則隨著疾病發展逐漸下調，C4則在早期中期下調而晚期上調。

C2中的SPP1可將乳腺成纖維細胞激活成促腫瘤的癌相關成纖維細胞（CAF），C3中的DCN在晚期腫瘤中下調且具有抗增殖和抗轉移的特性，TNXB在三個階段均下調且有報道稱該蛋白在多種實體瘤中下調且與較差的生存率相關。C4中具有腫瘤抑制作用的TINAGL1下調。這些結果強調了關鍵的ECM分子是如何在原發性乳腺癌進展中發揮重要作用，從促進腫瘤細胞增殖和侵入基質、向脈管系統遷移、血管內和血管中的傳播并導致轉移性疾病。

Fig.1 脫細胞乳腺癌蛋白質組圖譜揭示基質體的動態變化

膠原蛋白 XII 在乳腺癌發展過程中隨時間上調

比較健康脂肪墊和腫瘤的基質蛋白質組結果后發現了很多差異表達的ECM蛋白。其中，膠原蛋白XII（COL12A1）在所有時期的腫瘤基質中，與健康脂肪墊相比，均顯著上調表達，且隨著腫瘤發展，其表達逐漸上調。免疫組化（IHC）驗證發現膠原蛋白XII主要定位于基質區，表達變化趨勢與蛋白質組結果一致，證實了該蛋白作為關鍵基質支架蛋白的作用。已有報道表明膠原蛋白XII是正常組織中纖維狀膠原結構的調節劑，并且與腫瘤侵襲性相關。

Fig.2 隨著疾病的進展，XII膠原蛋白在乳腺癌中表達上調

膠原蛋白 XII 表達與腫瘤生物力學特性改變有關

為了評估膠原蛋白XII在原發性腫瘤進展中的潛在作用，研究者對膠原蛋白I/XII的空間組織和腫瘤生物力學進行了研究（膠原蛋白XII可與I結合發揮調節功能）。利用天狼星紅對組織中的纖維狀膠原蛋白染色和IHC切片分析發現在腫瘤進展過程中，總膠原蛋白與 XII 膠原蛋白一起增加。

無測限壓力測試分析測量腫瘤的生物力學特性發現腫瘤硬度（體積彈性模量）在疾病的晚期顯著增加，與質譜測得的XII膠原蛋白豐度增加相關。基于I型膠原纖維的非中心對稱性質，使用二次諧波發生（SHG）多光子成像技術對I型膠原進行無標記成像和量化。結果表明，I型膠原纖維密度在腫瘤發展的晚期上調，I型膠原纖維束尺寸的量化顯示，隨著腫瘤的進展，I型膠原束寬度增加。

隨著腫瘤從早期進展到中期和晚期，I型膠原纖維的線性度增加。這些數據證實了原發腫瘤進展過程中I型膠原纖維組織的廣泛重構。

Fig.3 XII膠原蛋白豐度與纖維狀膠原結構改變和腫瘤硬度相關

XII膠原蛋白在乳腺癌中表達上調，與不良預后有關

研究者使用TCGA數據庫乳腺癌隊列（BRCA）的RNA測序結果中XII膠原蛋白基因（COL12A1）表達數據進行預后研究，發現與非腫瘤組織相比，該基因在包括TNBC在內的所有原發乳腺癌組織中顯著上調。XII型膠原的高表達與總體存活率低(OS)和不良的無進展生存期（PFS）顯著相關。

多變量分析表明膠原蛋白XII的表達與腫瘤早期的進展更密切相關。為了證實上述發現，研究者對150名患者組織的膠原蛋白XII進行IHC分析，證實該蛋白高水平與疾病特異的存活率差顯著相關，并且患者的遠端復發率也更高。上述結果表明，XII膠原蛋白的表達與早期患者預后和復發密切相關，值得進一步研究以確定其作為侵襲性轉移疾病生物標志物的潛力。

Fig.4 XII膠原蛋白表達與乳腺癌預后不良相關

單細胞轉錄組揭示CAF提供了腫瘤微環境中的膠原蛋白XII

為了確認原發腫瘤微環境（TME）中膠原蛋白XII的來源，研究者從體內模型中收集5個原發晚期腫瘤組織進行單細胞RNA測序，證實了XII膠原蛋白編碼基因Col12a1在CAF的分泌基質亞型高表達，在另一個26名乳腺癌患者隊列的單細胞轉錄組結果中也發現XII膠原蛋白的主要來源是CAF。

接下來，研究者利用該患者隊列單細胞測序結果中CAF marker基因，對TCGA隊列每個乳腺癌數據集計算了CAF分數，發現COL12A1的表達與CAF分數呈顯著正相關，進一步證實了CAF是乳腺腫瘤中COL12A1的主要來源。但是分析還發現，膠原蛋白XII表達但沒有CAF分數也與總體和無進展的存活率顯著相關，將CAF分數添加到XII膠原蛋白生存模型中并不能顯著改善該模型，說明XII膠原蛋白的表達是這些患者預后的預測指標，與CAF分數無關。

Fig.5 小鼠和人乳腺癌中的CAF產生XII膠原蛋白

CAF分泌的XII膠原蛋白調節I型膠原結構、組織生物力學和癌細胞侵襲

研究者分析了從原發PyMT腫瘤中分離出的CAF和腫瘤細胞后發現，與正常小鼠乳腺成纖維細胞相比，這些CAF中的XII膠原蛋白表達上調，與單細胞轉錄組結果一致。從CAF細胞中敲除COL12A1并做了大量實驗發現，下調XII膠原蛋白的表達不會改變纖維膠原的總豐度，但會改變纖維膠原的超微結構，XII膠原蛋白在決定I型膠原纖維的空間組織結構中發揮了作用，并且CAF中XII膠原蛋白的枯竭可能起到了使基質正常化的作用。

此外，XII膠原蛋白敲除沒有改變CAF收縮I型膠原器官型基質的能力，而無限制壓力分析器官型基質的生物力學特征，揭示CAF中XII膠原蛋白的耗竭導致整體基質的硬度下降。XII膠原蛋白的敲除導致較薄的膠原束豐富程度較高，由于XII型膠原支架支撐著I型膠原的結合，這與XII型膠原已知的功能（即調節健康組織中I型膠原構型）是一致的。

最后，在CAF重塑的器官型基質里，先去除CAF后將PyMT癌細胞接種進去。結果表明癌細胞很容易侵襲到shScr-CAF（敲除模型的對照）重塑的基質中，但這種能力在敲除的CAF重塑基質中顯著降低，證實膠原蛋白 XII 對膠原蛋白 I 的調節，在原發性乳腺癌中產生促侵襲性微環境的重要作用。

利用Crisper激活構建膠原蛋白XII過表達的CAF細胞系，研究者發現CAF過表達XII膠原蛋白并不影響膠原重塑的速度，但確實顯著增加了CAF重塑的器官型基質的硬度和成熟的束狀膠原纖維的比例，并且顯著增加了PyMT癌細胞的侵襲性。這些結果表明，在CAF中增加XII膠原蛋白的表達與XII膠原蛋白的敲除具有相反的作用，并證實了XII膠原蛋白在調節腫瘤微環境中的纖維膠原結構和基質生物力學以及隨后的乳腺癌細胞侵襲中具有重要的作用。

Fig.6 XII膠原蛋白基因敲除調控原纖維膠原結構并抑制癌細胞侵襲

Fig.7 XII膠原蛋白過表達增強腫瘤硬度和癌細胞侵襲

CAF分泌的XII膠原蛋白創造了一個促進癌轉移的微環境

為了研究CAF分泌的XII膠原蛋白的作用，研究者將癌細胞與shScr、敲除后的CAF(癌細胞與CAF的比例為1：3)原位共植入第四乳房脂肪墊，并讓腫瘤最大成長到520mm3。研究發現對照和敲除組的腫瘤到達最大體積的時間和腫瘤重量沒有顯著差異，但腫瘤硬度在敲除組里顯著下降。肺組織切片觀察癌轉移發現對照組100%轉移，而敲除組約50%左右轉移，說明XII膠原蛋白在調節基質組織（可促進腫瘤細胞轉移擴散）中起著關鍵作用。

研究者還證實在敲除組腫瘤中較低的XII膠原蛋白水平降低，但兩組的CAF細胞量沒有差異。此外，I型膠原束厚度顯著減少，這與觀察到的腫瘤硬度降低相關。敲除組腫瘤中pMLC2（有研究指出pMLC2可激活腫瘤成纖維細胞并放大基質重塑，導致腫瘤硬度增加和促進腫瘤細胞侵襲的微環境產生）水平顯著低于對照組，癌細胞的轉移潛力也降低。

這些結果表明，CAF中的XII膠原蛋白缺失會導致正在發展的腫瘤內I型膠原束和腫瘤硬度改變，這可能導致基質總體激活水平較低，并破壞允許癌細胞侵襲的微環境。利用XII膠原蛋白過表達CAF進行與上述敲除組類似的實驗進一步證實XII膠原蛋白表達在轉移擴散中的重要作用。

總之，在體外和體內，這些互補的敲除和過表達模型實驗結果支持這樣的假設，即CAF在原發部位分泌的膠原蛋白XII調節I型膠原的結構和腫瘤的生物力學特性，從而創造了允許癌轉移的腫瘤微環境。

Fig.8 XII膠原蛋白基因敲除在體內減少癌轉移

Fig.9 XII膠原蛋白過表達在體內促進癌轉移

結果總結

本研究利用質譜技術描繪了脫細胞腫瘤隨時間變化的蛋白質組圖譜，揭示了乳腺癌發展過程中基質體的演變情況。研究者確定了四個關鍵的基質蛋白clusters，并明確指出XII膠原蛋白是調節I形膠原組織的關鍵成分。

通過將蛋白質組學和單細胞轉錄組數據聯合分析，并使用遺傳操作模型，研究者展示了由CAF分泌的XII膠原蛋白是如何改變I型膠原組織，以創造支持轉移擴散的促侵襲微環境。此外，在TCGA的患者隊列中，研究者發現XII膠原蛋白可能代表了乳腺癌患者轉移復發的高風險指標。

審核編輯：劉清