與傳統的大腦成像技術相比，光纖光度法越來越受歡迎，它可以更好地掌握大腦的內部運作。隨著方法的不斷改進，這是一個新技術的開始。

圖 1. 多通道光纖光度測量系統（photometry system）的構建。488nm 激光器的光束通過物鏡同時耦合到一系列多模光纖中。然后發射的熒光由同一組光纖收集并由 sCMOS 相機 (a) 檢測。雙通道模式 (b) 和四通道模式 (c) 的 sCMOS 相機上的光纖端面。

對大腦復雜性的全面、完整的理解仍然難以捉摸。揭開它的奧秘是了解神經系統疾病的關鍵——從阿爾茨海默氏癥（Alzheimer’s）和癡呆癥（dementia）到癲癇（epilepsy）和多發性硬化癥（multiple sclerosis）——以及更有效地治療甚至治愈它們的能力。

長期依賴的非侵入性成像技術（non-invasive imagingtechniques），如 MRI 和 CT 掃描提供了對大腦內部的觀察條件，但使用光纖的方法顯示出更為良好的效果，尤其是光纖光度法（fiber photometry）。

光纖光度法是一種用于研究神經回路的光學成像技術，最初由慕尼黑路德維希馬克西米利安大學（Ludwig Maximilian Universityof Munich）的一個團隊于 2005 年開發，用于記錄新生小鼠靜息時的皮質（大腦外層the outer layer of the cerebrum）鈣離子波(Ca2+) 。它涉及將光纖植入大腦，以觀察和記錄大腦不同區域內特定類型細胞的神經元群體水平（population-level）的 Ca2+ 活動。在大腦中，鈣活動是控制突觸運動和記憶形成等活動的核心。

與基因編碼（genetically encoded）的鈣指示劑（calcium indicators）結合使用，纖維光度法可以實時監測神經活動。

“纖維光度法提供了一種獨特的功能，可以輕松穩定地記錄自由活動動物中具有細胞類型特異性的種群活動，” 華中科技大學的Ruonan Fan 博士說。她在華中武漢光電子國家實驗室助理主任、布里頓機會生物醫學光子學中心首席研究員傅玲領導的實驗室工作。

不斷增長的優勢

雖然低時間和空間分辨率是一個顯著的挑戰，但光度法仍然是優于其他鈣成像技術（如單光子或雙光子顯微鏡）的首選方法。光纖更容易植入，重量也更輕，允許受試者自由移動和執行自然行為，這也是該技術的關鍵。光纖光度法也更能抵抗電磁干擾，更有效地收集數據，并且迄今為止已被證明對于長期神經監測更穩定。

“它已成為神經科學中一種廣泛使用的光學方法，”范博士提到，并引用了 Fu 教授團隊在 2015 年開發的可擴展多通道光纖光度測量系統，該系統可以同時監測動物甚至不同動物的多個大腦區域的神經活動。

Fu 實驗室領導的另一項研究涉及在 2019 年開發特定于軸突末端的多通道光纖光度計。研究小組在研究中解釋說，軸突主要通過其末端的突觸將信息從一個神經元傳輸到另一個神經元，并且“從自由移動動物的軸突末端記錄是了解動物行為過程中信息處理的重要步驟。”

現在，由 Fu 團隊領導的正在進行的研究（今年 5 月首次發表）在傳統技術的基礎上提供了更多優勢。

“我們開發了一種兼容且靈活的全光纖傳輸光度測量系統，”范說。“我們可以同時實現光遺傳學操作和神經元活動的多色記錄以及自由移動（neuronal activities）動物的神經遞質釋放（neurotransmitter release）。”

該團隊一直在研究在動物行為期間以細胞類型特異性和精確的時空分辨率來操縱和實時監測神經元活動。“這些是探索體內神經回路的功能連接、信息傳遞和生理功能的基礎技術，”范說。

新的全光纖傳輸光度測量系統基于多分支光纖束（圖 1）。它允許在自由移動的動物中同時進行光遺傳學操作和多色記錄神經元 Ca2+（或神經遞質信號）。

“這是對當前光纖光度測量系統的有效補充，”范說。

新系統實現了對可見光譜（visible spectrum）的全覆蓋，用于多色激發和光遺傳學（optogenetic）操作，以及激發和發射光的全光纖傳輸。范說，這是通過結合非波長選擇性四分支纖維束專門完成的，該纖維束可以實現多色記錄（multicolor recording），同時還支持精確的光遺傳學刺激（圖 2）。該束與光電倍增管 (PMT) 相結合，以取代傳統的成像結構。還使用了定制設計的鎖定放大器，以準確分離 PMT 檢測到的具有不同波長的兩個熒光信號，并有效抑制光遺傳學刺激引起的偽影（artifacts）和通道串擾(channel crosstalk)。

圖 2. 定制設計的四分支光纖束和多功能光纖光度測量系統。四分支纖維束（a）包括單纖維分支（i~iii）、集合分支（iv）和公共分支（v）。四分支光纖束 (b) 普通分支 (v) 示意圖。公共分支 v (500 μm) 總共由 85 根六邊形分布式光纖 (Φ50 μm/0.54 NA) 組成。束中心的三個較亮的光纖對應于三個單光纖分支 (i~iii)，用于耦合到三個不同的激發光。四分支光纖束構建的多功能光纖測光系統示意圖。將三個不同波長的光源耦合到多模光纖中，并通過三個單纖分支 i~iii (c) 連接到鼠標。多功能光纖測光系統的鎖定放大器示意圖（d）。這兩種激發光由具有不同頻率（450 nm，211 Hz；561 nm，531 Hz）的正弦信號調制。

“我們進行了一系列實驗，表明該系統具有出色的透光性能。它能夠有效地激發和收集熒光信號，收集效率比傳統系統提高 20% 到 30%。”范說。

研究小組沒有發現實質性的通道串擾，并成功記錄了伏隔核 (NAc) 中的神經元 Ca2+ 和神經遞質動態信號——一種主要由中等多刺神經元組成的結構，其特點是多巴胺受體（dopamine receptors）的相對表達——同時在自由移動的小鼠身上對同一部位的多巴胺能末端進行精確的光遺傳學操作。研究人員還能夠在記錄時將刺激偽影（由于它們是非生理性的而導致噪聲干擾的短時間、高振幅的神經尖峰）抑制到基礎噪聲水平（basal noise level）（圖 3）。

圖 3. 自由移動小鼠 NAcLat（伏隔核外側殼）中神經元活動的同時雙色記錄和光遺傳學操作。 (a) 神經元活動手術同步雙色記錄和光遺傳學操作示意圖。 (b) 組織學證實 NAcLat 中 GFP (綠色) 標記的神經元和 ChrimsonR (紅色) 標記的多巴胺能神經元末端表達。腦切片在前囟前 1.1 毫米處。 (c) 在該系統中同時進行光遺傳學操作和實時雙色記錄時不存在刺激偽影。紅色條表示刺激時間。 (d) 在自由移動的小鼠的 NAcLat 中同時記錄的 DA 和神經元 Ca2+ 痕跡的示例。 (e) 響應階段性光遺傳學刺激的平均 DA 信號和神經元 Ca2+ 信號瞬變（10 次試驗）。紅色條表示刺激時間。橙色段表示從基線統計顯著增加。 (f) 響應強直光遺傳學的平均 DA 信號和神經元 Ca2+ 信號瞬變。紅色條表示刺激時間。

“隨著它的進步，纖維光度法在神經科學家中越來越受歡迎，作為記錄基因定義的神經元群體的便捷工具，”范說。“而后續的改進主要集中在不同的應用需求上。”

早期用于光遺傳學操縱或記錄神經元活動的光纖測光技術和系統通常是分開的并獨立工作，它們只能在單個波長下進行操縱和單通道記錄。另一個挑戰是，由于光敏蛋白（spectrum of photosensitiveproteins）的激發光譜與基因編碼的鈣指示劑的發射光譜之間的重疊，在多色記錄和操作過程中會出現刺激偽影（stimulation artifacts）。

“為了同時實現光遺傳學操作和雙色記錄，需要涉及更多具有光譜間距的波長范圍熒光蛋白，”范說。“因此，光學系統需要完全覆蓋可見光譜。”

但范補充說，這是目前可用的光纖光度測量系統的一個問題，因為它們使用經典的落射熒光成像架構（classical epifluorescenceimaging architecture）僅覆蓋 405 到 600 nm 左右的光譜，該架構由一個物鏡和兩個或三個二向色鏡組成。 “在這種情況下，”她說，“需要更多的分色鏡將多波長光束耦合到一根光纖中，這使得系統擴展光譜更加復雜。”

新的全光纖傳輸光度測量系統可用于“進一步觀察不同類型神經元的活動，同時進行光遺傳學操作和多色記錄，以監測光遺傳學干預神經回路引起的反饋效應，”范說。 “這現在被認為是神經回路和神經系統疾病因果研究的‘夢想方法’。”