中國江浙和歐洲，是葉堅教授讀大學以來待過最久的兩個地區。早年，他在浙江大學和比利時天主教魯汶大學分別獲得碩士學位和博士學位。而他后來工作的比利時微電子研究中心（IMEC），與魯汶大學緊緊相鄰。

葉堅說：“在魯汶大學和IMEC我度過了8年時光。魯汶大學是歐洲最古老的大學之一，即將迎來600周年校慶；IMEC是世界領先的微電子研究中心。古老和現代在這里碰撞和融合，歐洲大學嚴謹的治學態度和深厚的文化底蘊、IMEC勇于探索的做事風格和先進的技術理念，都給我帶來了深遠影響，讓我形成了從容的為人處世風格和科研治學的態度。”

2013年，葉堅離開比利時，回國加入上海交通大學生物醫學工程學院，聚焦于納米技術與臨床醫學的交叉研究。前不久，他和團隊將超亮的表面增強拉曼光譜（SERS，Surface-enhanced Raman spectroscopy）納米探針，與自制的透射拉曼裝置相結合，開發出一款拉曼檢測/成像系統，讓拉曼光學信號可以穿透14厘米深的肌肉組織并進行檢測。



（來源：Small Methods）

該技術的進一步應用將在很大程度上推進疾病的無創傳感和篩查。例如，表面增強拉曼光譜已被成功用于人源化小鼠模型血管炎癥的體內檢測和深度多重分子成像，這說明其作為心血管疾病臨床成像技術，具備不錯的應用前景。

同時，當這項技術與透射拉曼裝置結合，有望實現活體小鼠深層血管炎癥的體內、無創、實時成像。此外，還可通過多對激光探測器或旋轉激光探測器，實現基于透射拉曼光譜的三維層析成像。

不過，也要注意到透射拉曼光譜的現有不足——即分辨率相對較低。在生物醫學應用中，納米探針的生物安全性和靶向腫瘤的效率等問題也很重要，特別是在體內成像方面，而這可以通過選擇合適的表面涂層或配體來改善。

葉堅認為，未來很有希望開發局部注射或使用納米探針的體內應用，比如在前哨淋巴結成像的用途中，一般是在腫瘤周圍注射納米顆粒，切除前哨淋巴結、以及其包含的納米顆粒，從而顯著降低安全風險。

另外，結合之前一些基于透射拉曼的深度估計方法，該項技術有望對肥胖患者體內被厚脂肪覆蓋的前哨淋巴結，進行精確定位和深度估計。總的來說，課題組非常期待關于透射拉曼光譜的臨床應用。

近日，相關論文以《在最大允許暴露下的體內表面增強透射拉曼光譜：用于深層腫瘤的光安全檢測》（In Vivo Surface-Enhanced Transmission Raman Spectroscopy Under Maximum Permissible Exposure: Toward Photosafe Detection of Deep-Seated Tumors）為題發在Small Methods期刊上（IF 15.4）。



圖 | 相關論文（來源：Small Methods） 論文第一作者為上海交通大學生物醫學工程學院博士生張玉敏，上海交通大學生物醫學工程學院林俐助理教授和葉堅教授為共同通訊作者。

光學檢測和成像方法：腫瘤診斷的絕佳工具

據介紹，體內腫瘤病灶的無創檢測，對于臨床醫學腫瘤診療至關重要。當下，外科手術是治療惡性實體瘤的主要方法，一些醫學成像技術比如核磁共振、計算機斷層掃描和超聲成像等，雖然可以獲得內部腫瘤病灶的位置信息，但是由于采集時間長、儀器昂貴或輻射劑量大等原因，更多被用于術前診斷。

與之相比，光學檢測和成像方法具有實時、高靈敏、非電離輻射、采集方便等優勢，結合外源性造影劑可以提供關于生物體結構、功能和分子的精確信息，是腫瘤診斷的絕佳工具。

目前，多種光學造影劑和導航系統已被開發出來，借此可以使用寬場照明進行大范圍成像、或者用手持式探頭逐點探測微小病灶。

目前，基于吲哚菁綠的分子影像導航，在肺癌、腦膠質瘤、乳腺癌、肝癌和結直腸癌等腫瘤手術中均已實現臨床轉化，并可以實時、動態地檢測乳腺前哨淋巴結。

然而，現有的腫瘤光學檢測技術的進一步發展也面臨著相關瓶頸：組織穿透深度較低、無法檢測深層病灶，主要原因是生物組織對于光子有著強烈的散射與吸收作用。

例如，近紅外區域肌肉組織的傳輸平均自由程只有1-2毫米。目前廣泛使用的背散射式熒光成像技術的組織穿透深度通常只有幾毫米，對于1厘米以上的深層病灶容易出現漏診。

比如，臨床結果顯示，基于吲哚菁綠的術中成像，無法檢測到距離胸膜深度超過1.3厘米的肺結節，從而會造成假陰性。因此，亟需開發一個能夠檢測深層病灶的光學方法，這對于實現高質量的臨床醫學診斷也非常重要。

從目前已有報道來看，透射拉曼光譜技術可以實現具有高組織穿透能力的非侵入性檢測。但是，透射拉曼光譜技術的最新水平，依舊無法滿足實際生物醫學應用的要求。

首先，之前文獻中報道的透射拉曼光譜技術的檢測深度或組織厚度，仍遠低于與人類相關的數值。

例如，人類的腹背距離淵源超過10厘米：兒童的平均厚度為17厘米，成人為22厘米。而使用透射拉曼光譜穿透超過10厘米的離體厚組織或活體動物的可行性，至今尚未得到證實。

其次，人們依舊不清楚光子在透射拉曼檢測中的傳播過程以及測量因素，亦不明確信號受到影響的規律。

一般來說，透射拉曼光譜信號不僅受到組織散射和吸收系數的影響，還可能與表面增強拉曼散射納米探針的亮度、埋藏病變的深度、組織的總厚度等因素有關。評估這些決定性因素之間的關系，也是必不可少的。

再次，激光安全性是光學檢測和成像模式在臨床轉化中長期受到關注的問題。臨床激光的光安全性，一般通過最大允許曝光量來評估，即對身體暴露表面造成損害的風險可忽略不計的最高光輻照度或輻射量。

然而，在大多數體內表面的增強拉曼光譜研究里，人們使用的激光劑量遠高于最大允許曝光量極限，這在很大程度上阻礙了表面增強拉曼光譜技術的臨床應用。

針對上述問題，該團隊進行了深入研究并，最終解決了光照安全劑量的問題。期間他們也發現了一些新知識：

第一，所檢測到的透射拉曼信號與病灶在組織中的深度，兩者之間呈U型關系，這說明當病變位于組織中部時，信號最弱、對透射拉曼光譜的檢測也最具挑戰性；

第二，提高表面增強拉曼散射納米探針的亮度，是增加檢測深度/透射組織厚度最直接有效的方法；

第三，激光束尺寸的增大幾乎不影響深層病灶的透射拉曼強度，即可采用更大光束的尺寸，來降低激光的功率密度。得益于這些發現，讓他們獲得了本次成果。



（來源：Small Methods）

為什么能實現10厘米以上的穿透深度？

前文提到，該研究的大方向是利用深拉曼技術進行超高穿透深度的探索。課題組了解到，在已報道的深拉曼光譜技術中，透射拉曼光譜技術的深層檢測能力最強，并且他們也從初步試驗中證明了這一觀點。

如前所述，透射拉曼光譜技術的最新水平還不能滿足實際生物醫學應用的要求。因此，他們定下了這樣一個研究目標：實現10厘米以上超高組織檢測深度/厚度。

非常幸運的是，提出目標不久之后就被實現了。充滿喜悅的同時，也給該團隊帶了極大的困惑，那就是為什么能實現？

此外，他們所發現的新知識——即透射拉曼信號與病灶在組織中的深度兩者之間是呈U型關系的，這和想象中的差異很大。

基于上述發現和困惑，課題組提出了新的探索方向，對透射測量過程的物理機制進行深入挖掘。

期間，他們利用光子傳輸理論與輻射傳遞方程，對拉曼光子在組織中的傳播過程進行研究，借此發現了前文提到的新知識，回答了大家的疑惑：即為什么能實現10厘米以上的穿透深度。



（來源：Small Methods）

接下來則是在安全激光照射范圍內，進行相關實驗以及論文撰寫。葉堅表示：“我們在把上一階段得到的結果和同行交流，得到了一個重要的反饋：‘這么高的穿透深度，能不能用極低的激光功率實現呢？’”

對于活體檢測應用來說，這個問題非常重要。因為激光安全性是光學模式臨床轉化中長期關注的問題。

臨床激光通常被規定一個最大允許曝光量的閾值，然而目前大多數體內表面增強拉曼光譜研究，所使用的激光劑量遠高于最大允許曝光量極限，這在很大程度上阻礙了表面增強拉曼光譜技術的臨床應用。

于是，他們再次開展理論計算，結果發現增大激光光束尺寸時，雖然會降低激光功率密度、影響淺表病灶的信號強度，但幾乎不會影響深層病灶的信號強度。

原因在于，生物組織是高度散射體，光束在組織中傳播后都將呈現擴散趨勢。因此無論是使用聚焦光束還是擴散光束，對于深層病灶都是一樣的效果。

這意味著課題組可以直接采用更大尺寸的擴散光束，實現深層病灶的檢測，從而顯著降低照射到組織表面的激光功率密度。

“總而言之，經過多方努力我們終于從光子傳輸理論中窺見端倪，初步得到了令人滿意的答案。對于將透射拉曼光譜技術用于無創體內生物醫學檢測，這一發現是至關重要的。”葉堅說。



（來源：Small Methods）

既然此次工作實現的是深層病灶的無創檢測，那么進一步地能否在檢測這些深埋于表面以下的病變的同時，獲取它們的深度信息？

在當前的臨床程序里，通常人們從經皮或術中掃描的醫學成像著手，借此確定病變的位置。從治療策略的設計、到手術規劃和手術指導，預估體表以下病灶的深度，對于臨床診斷起著關鍵作用。

例如，在對患者進行光動力治療之前，精確估計病變的深度有助于確定藥物類型、劑量和激光參數。

此外，前哨淋巴結活檢，通常包括識別和切除前哨淋巴結。準確估計前哨淋巴結的深度，可以縮短手術識別過程，降低前哨淋巴結切除過程中出血的風險。

在腫瘤治療方面，腫瘤深度信息可以用來判斷結直腸癌的分期，進而幫助制定治療策略。

綜上，發現病變并獲取病變深度信息，對于臨床診治的重要性不言而喻。

后續，該團隊希望在此方向繼續深入探索，計劃開發一種簡單、光安全的方法，以便快速、準確地判斷組織中深層病變的深度信息。

審核編輯：劉清