抗生素是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的藥物，用于治療各種細(xì)菌疾病，提高飼料利用率，并減少對某些營養(yǎng)素的需求。迄今為止，科學(xué)家已經(jīng)建立了高效液相色譜法、質(zhì)譜法和酶聯(lián)免疫吸附測定法等多種抗生素分析技術(shù)。然而，盡管這些方法靈敏度高，但樣品前處理復(fù)雜、儀器昂貴、勞動強(qiáng)度高、人員訓(xùn)練有素，極大地限制了其應(yīng)用。與納米材料結(jié)合的熒光檢測技術(shù)具有檢測限超低、實時快速檢測、檢測范圍大、成本低等無可比擬的優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于抗生素的檢測。 近年來，核酸適配體技術(shù)已經(jīng)成為食品摻假和污染物快速檢測的領(lǐng)跑者。

與抗體相比，核酸適配體表現(xiàn)出更好的特性，包括更高的親和力、更高的特異性、更高的穩(wěn)定性和更容易標(biāo)記。目前，已有研究人員開發(fā)出了一種基于信號放大策略的雙目標(biāo)電化學(xué)適配體傳感器，用于高靈敏度地同時檢測卡那霉素和鏈霉素。然而，目前還沒有紙基微流控適配體傳感器與熒光納米顆粒結(jié)合用于抗生素的多重檢測。 基于此，江南大學(xué)吳世嘉教授團(tuán)隊設(shè)計了一種基于多色熒光碳點（CDs）適配體傳感器的激光打印紙基微流控芯片（mCD-μPAD適配體傳感器），實現(xiàn)了多種抗生素的同時檢測。

此外，還設(shè)計了一種3D打印的便攜式檢測盒，可以通過智能手機(jī)直觀地分析磺胺二甲嘧啶（SMZ）、土霉素（OTC）和氯霉素（CAP）。通過智能手機(jī)識別熒光紙張圖像的RGB值，可以實現(xiàn)對水產(chǎn)品中多種抗生素的同時可視化檢測。文章以“Laser-Printed Paper-Based Microfluidic Chip Based on a Multicolor Fluorescence Carbon Dot Biosensor for Visual Determination of Multiantibiotics in Aquatic Products”為題發(fā)表在ACS Sensors期刊上。

首先，研究人員通過水熱法合成了多色熒光CDs，然后與抗生素適配體和MoS?納米片結(jié)合，合成了“熒光關(guān)閉”檢測納米探針，如方案1A所示。然后，在自行設(shè)計的激光打印微流控紙基芯片的三個檢測區(qū)重復(fù)滴加三個檢測納米探針溶液，制成方案1B中的mCD-μPAD適配體傳感器。檢測過程如方案1C所示。

在沒有靶點的情況下，CDs通過π-π堆積作用與MoS?納米片形成的CDs-apt導(dǎo)致mCD-μPAD上的熒光猝滅，這可以促進(jìn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）過程的形成。然而，當(dāng)樣品溶液被mCD-μPAD適配體傳感器吸附時，溶液中的抗生素會在濾紙的毛細(xì)作用下遷移到檢測區(qū)。然后，它們各自的適配體特異性地識別它們，并形成伴隨構(gòu)象變化的適配體/靶點復(fù)合體。

在這種情況下，CDs和MoS?之間的距離變大，阻礙了能量的傳遞。通過便攜式檢測設(shè)備和可用的智能手機(jī)拍攝檢測區(qū)域中的熒光顏色變化，可以通過安裝的顏色識別應(yīng)用程序提取捕獲的熒光圖像或?qū)崟r圖像的RGB通道值，并將其轉(zhuǎn)換為灰度值。圖像的灰度值與抗生素的濃度成正比。

方案1 mCD-μPAD適配體傳感器和便攜式智能手機(jī)檢測儀同時檢測多種抗生素

制備的三種CDs為分散均勻的球狀顆粒，平均粒徑分別為3.49 nm ± 0.63 nm、4.74 nm ± 0.65 nm和5.03 nm ± 0.69 nm（圖1a-1c）。三種CDs的紅外光譜相似，都具有C-O-C（1195/cm、1166/cm和1145/cm）、C-N（1417/cm、1394/cm和1400/cm）、C=O（1720/cm、1627/cm和1621 /cm）和O-H/N-H（3502/cm、3413/cm和3437/cm）伸縮振動和N-H（779/cm、827/cm和912/cm）彎曲振動（圖1d-1f）。用X射線光電子能譜對三種CDs的表面元素分析表明，多色CDs含有原子含量不同的C（284.8 eV）、N（400 eV）和O（531 eV）（圖1g?1i）。



圖1 （a）rCDs、（b）gCDs和（c）bCDs的TEM圖像和粒徑分布直方圖；（d）rCDs、（e）gCDs和（f）bCDs的FT-IR光譜；（g）rCDs、（h）gCDs和（i）bCDs的XPS譜 用UV-Vis吸收光譜、熒光激發(fā)和發(fā)射光譜研究了多色熒光CDs的光學(xué)性質(zhì)（圖2a-2c）。三種CDs在530 nm、360 nm和370 nm處的吸收帶分別與614 nm、490 nm和470 nm處的發(fā)射的激發(fā)光譜重疊。

rCDs在530 nm吸收峰歸屬于C=N鍵，gCDs和bCDs的360 nm和370 nm吸收峰歸屬于碳核的n→π*躍遷。在激發(fā)波長為518 nm、362 nm和374 nm時，三種CDs的最大發(fā)射波長分別為614 nm、493 nm和439 nm。



圖2 （a）rCDs、（b）gCDs和（c）bCDs的熒光和吸收光譜

通過ζ電位表征了適配體與CDs的結(jié)合（圖3a-3c）。rCDs、gCDs和bCDs的ζ電勢分別在-2.33 mV ~ -11.7 mV、-8.81 mV ~ -12.2 mV和-8.86 mV ~ -14.7 mV之間變化，這是由于適配體磷酸骨架上豐富的負(fù)電荷。如圖3d-3f所示，在CDs-apt中添加MoS?復(fù)合材料顯著猝滅了熒光強(qiáng)度（c線），在CDs直接摻入MoS?后，發(fā)光強(qiáng)度僅輕微猝滅（b線）。

此外，隨著靶點的加入，復(fù)合體系（CDs-apt-MoS?）的熒光強(qiáng)度顯著恢復(fù)（d線）。此外，還驗證了在μPAD上安裝檢測探針的可行性。μPAD在365 nm激發(fā)波長下的檢測區(qū)的熒光強(qiáng)度按a、b、d、c的順序逐漸減小，這與溶液中的結(jié)果一致。



圖3 （a）rCDs和rCDs-atp1、（b）gCDs和gCDs-atp2、以及（c）bCDs和bCDs-atp3的ζ電勢；（d）rCDs-atp1-MoS?、（e）gCDs-atp2-MoS?和（f）bCDs-atp3-MoS?納米探針在溶液中檢測抗生素的可行性

如圖4a所示，整個μPAD是半徑為30 mm的扇區(qū)。三種不同形狀的檢測區(qū)域和三個圓形緩沖區(qū)通過三個微通道與親水尖端相連。使用緩沖區(qū)，以避免由于檢測過程中液體流動速度過快而導(dǎo)致檢測探頭堆積在檢測區(qū)域的上部。圖4b、4c顯示了白天和365 nm激發(fā)光打印的多色熒光碳點附著在μPAD的照片。

通過掃描電子顯微鏡技術(shù)，可以認(rèn)為檢測區(qū)浸入了CDs -apt -MoS?納米探針。圖4d、4e顯示了不同尺度下μPAD的空白檢測區(qū)，其中只能觀察到濾紙的纖維組織。在圖4f中，可以觀察到它們附著在纖維素過濾器的表面，并在將納米探針滴到檢測區(qū)后在一定程度上聚集在一起。

為了獲得更好的檢測性能，對MoS?的負(fù)載濃度和靶點孵育時間進(jìn)行了優(yōu)化。從圖4g-4i中可以看出，隨著MoS?在納米探針中濃度的增加，相應(yīng)濃度的μPAD的灰度值和熒光圖像都逐漸下降，紅色和綠色探針穩(wěn)定在0.25 mg/mL，藍(lán)色探針穩(wěn)定在0.30 mg/mL。

因此，rCDs和gCDs探針的最佳濃度為0.25 mg/mL MoS?，bCDs探針的最佳濃度為0.30 mg/mL MoS?。此外，通過確定抗生素濃度（100 ng/mL）來優(yōu)化目標(biāo)孵育時間。結(jié)果表明，所有顏色的灰度值隨著時間的推移而逐漸增加，并在15分鐘時趨于穩(wěn)定（圖4j-4i）。因此，15 min為最佳孵化時間。



圖4 （a）μPAD的示意圖；μPAD在日光下（b）和在365 nm紫外光下附著多色熒光碳點的照片；在（d）100 μm和（e）10 μm處添加檢測探針之前的檢測區(qū)的掃描電子顯微鏡圖像；（f）在10 μm處添加檢測探針之后的檢測區(qū)的掃描電子顯微鏡圖像；（g）rCDs檢測探針、（h）gCDs檢測探針和（i）bCDs檢測探針的MoS?濃度的優(yōu)化；（j）rCDs檢測探針、（k）gCDs檢測探針和（i）bCDs檢測探針的孵育時間的優(yōu)化

通過便攜設(shè)備平臺和智能手機(jī)同時檢測SMZ、OTC和CAP。此外，為了使mCD-μPAD適配體傳感器可用于抗生素的現(xiàn)場定量，并提供穩(wěn)定的分析環(huán)境，設(shè)計了一種3D打印的便攜式檢測裝置。該設(shè)備的組成和結(jié)構(gòu)的照片如圖5a、5b所示。它由一個由電池供電的365 nm紫外光和一個帶有高質(zhì)量互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體相機(jī)的智能手機(jī)組成。檢測過程如圖5c所示。檢測后，將μPAD放入裝置托盤，在365 nm激發(fā)光源下激發(fā)。智能手機(jī)被放置在盒子的頂部，通過觀察孔捕捉到平板的熒光信號。

在最佳條件下，用mCD-μPAD適配體傳感器對SMZ、OTC和CAP進(jìn)行可視化檢測。如圖5d-5f所示，隨著標(biāo)準(zhǔn)樣品中SMZ、OTC和CAP濃度的增加，rCDs、gCDs和bCDs的熒光強(qiáng)度逐漸恢復(fù)。然后，通過顏色識別軟件提取熒光圖像的RGB值，并將其轉(zhuǎn)換為灰度值，通過公式進(jìn)行計算，相應(yīng)的檢出限分別為0.47 ng/mL、0.48 ng/mL和0.34 ng/mL。



圖5 便攜式檢測裝置的（a）制備、（b）組成和（c）使用的示意圖；mCD-μPAD適配體傳感器的熒光圖像以及（d）紅、（e）綠和（f）藍(lán)檢測區(qū)域的Δ灰度值與對數(shù)的SMZ、OTC和CAP濃度之間的校準(zhǔn)曲線 用該方法檢測了水產(chǎn)品中可能存在的磺胺嘧啶（SDZ）、磺胺二甲氧嘧啶（SMS）、四環(huán)素（TC）、恩諾沙星（ENR）和紅霉素（ERY）等幾種常見抗生素。其中，SDZ和SMS是SMZ的結(jié)構(gòu)類似物，TC是OTC的結(jié)構(gòu)類似物。如圖6所示，這些抗生素僅引起較小的灰度值變化。相比之下，SMZ、OTC和CAP可導(dǎo)致相應(yīng)檢測區(qū)域的顯著增加。



圖6 mCD-μPAD適配體傳感器的特異性和交叉反應(yīng)性

綜上所述，該研究利用多色熒光發(fā)射N-CDs和MoS?納米片作為FRET供體?受體對，成功構(gòu)建了一種多色熒光納米探針紙基微流控芯片，可同時監(jiān)測3種常用抗生素。使用3D打印便攜設(shè)備和現(xiàn)有的智能手機(jī)，可以通過安裝的顏色識別應(yīng)用程序?qū)崿F(xiàn)熒光圖像的快速捕獲和RGB通道值的即時分析。

通過改變相應(yīng)的適配體，μPAD可應(yīng)用于其他抗生素的檢測。在進(jìn)一步的研究中，將努力分散在微型光學(xué)配件的設(shè)計上，以減輕檢測系統(tǒng)的重量和體積，并開發(fā)智能手機(jī)應(yīng)用程序，整合圖像處理和數(shù)據(jù)分析，提高性能?？傮w而言，該紙基傳感器具有試劑消耗低、檢測成本低、制作簡單、靈敏度高、效率高等優(yōu)點，為食品安全與控制的同步監(jiān)測提供了一種很有前途的策略。

審核編輯：劉清