核酸適配體是一種短的單鏈DNA或RNA分子，其具有穩定性高、結合能力強、便于修飾、成本低等優點，被廣泛應用于制作各種靶標分子的生物傳感器。傳統的適配體篩選采用指數富集法（SELEX），即通過反復的篩選和擴增，從單鏈寡核苷酸庫中富集出與靶標結合的適配體。該方法無法定量生產所需結合親和力的適配體，且耗時耗力。近些年來研究者們開發了如CE-SELEX、Non-SELEX以及M-SELEX等技術，提高了適配體的篩選效率，但仍無法定量生成具有特定結合親和力的適配體。

近期，美國西北大學的Shana O. Kelley教授團隊開發了一種名為“Pro-SELEX”的新方法，用于定量分離具有可編程結合親和力的適配體。該工作以“A high-dimensional microfluidic approach forselection of aptamers with programmable binding affinities”為題，發表在Nature Chemistry期刊上。

Pro-SELEX的整體流程如圖1a所示，首先將單鏈寡核苷酸庫轉化為單克隆適配體粒子（AP），在每個粒子的表面展示了單個核酸序列的多個拷貝，產生AP文庫。然后將其與不同濃度的靶標一起進行孵育，使用微流控芯片分離具有不同靶結合水平的AP，進行測序分析，鑒定出具有不同結合親和力的適配體。具體的分選方法如圖1b所示，AP文庫與生物素化的靶標結合后，再用抗生物素磁性納米顆粒（MNP）去標記靶標，將結合了靶標的適配體粒子賦予磁性，隨后送至微流控裝置中分選。該微流控裝置分為四個區，當外界設定流量Q相同時，四個區域會因截面積A的不同而展現出不同的流速V（即Q=A*V）。第一區流速最大，若適配體與靶標結合能力強，則其磁性高，磁力能夠克服流體高流速產生的拖曳力，則被保留下來。而親和力較低的適配體粒子因磁性較弱，無法克服拖曳力而被帶到下一個區域。后三個區域流速遞減，同理可根據不同的親和力進行分選（圖1c, d）。該微流控芯片的流量是可調整的，具備可編程性（圖1e）。

圖1 微流控方法定量分離不同結合親和力的適配體

接下來，研究人員將該方法用于分選凝血酶適配體。在核酸文庫中，同種適配體對靶標的親和力存在差異。以03適配體為例，研究人員首先測試了該微流控芯片是否可以分類不同靶結合水平的AP（圖2a）。將AP與不同濃度的靶標共同孵育并用磁珠標記（圖2b），分別在兩種不同的流量下對這些粒子進行分選（圖2c、2d）。在8 mL/h的流量下，高磁性粒子主要被捕獲在芯片的1區，當流量增加到16 mL/h時，部分移動到2區，而低磁性粒子主要聚集在后面的區，幾乎所有的非靶結合粒子都在W區中被檢測到。上述結果表明，該微流控芯片能夠根據AP的靶結合水平對其進行分類和捕獲，其中靶標濃度對分離效率起著顯著的作用。此外，不同適配體（03和TBA）對靶標的親和力也不同。研究人員分別采用流式細胞儀（圖2e~2g）及Pro-SELEX芯片篩選（圖2h~2j），結果也證實了該芯片能夠分選不同親和力的AP。

圖2 Pro-SELEX分選性能驗證

然后，研究人員研究了Pro-SELEX平臺是否能高效地篩選適配體。以人髓過氧化物酶（MPO）作為模型，AP文庫在5種MPO濃度下以兩種流量進行測試，分離出不同親和力的適配體（圖3a）。結果表明，該微流控芯片捕獲的AP組分隨著目標濃度的降低而減少（圖3b）。而當流量升高時，AP庫的分選布局發生了變化（圖3c），突出了該方法的高分辨率。隨后，研究人員將收集到的DNA文庫進行高通量測序，并創建了一種評分工具，用于分析適配體的富集倍數并產生Z分數（圖3d、3e）。此外，研究人員還隨機選擇了八種適配體測定其Kd（圖3f），通過曲線擬合發現它們的Kd值與Z分數之間存在線性關系（圖3g），表明Z評分可用于篩選特定親和力的適配體。

圖3 使用Pro-SELEX篩選MPO適配體

最后，研究人員探究了Z分數是否可以用于定量篩選具有所需結合親和力的適配體?；赯分數和適配體的Kd值之間的相關性產生“檢索帶”（圖4a）。通過評估不同Z分數范圍內多個適配體的結合親和力，“十分匹配”的成功率在20%到50%之間。表明在Z分數范圍內測試不超過5個候選適配體，就可識別出一個具有所需結合親和力的適配體（圖4b）。MPO的四種特定親和力的適配體成功被篩選出來（圖4c）。

圖4 定量分選具有所需親和力的MPO適配體

總結來說，該研究開發了一種新的適配體篩選方法，其能夠高效、定量地生成具有所需結合親和力的適配體。Pro-SELEX方法具備可編程性，可捕獲從小分子到病毒或細菌的各種靶標，具備廣闊的應用前景。

責任編輯：彭菁