單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）方法自2005年創(chuàng)立以來，已廣泛應(yīng)用于真核生物領(lǐng)域。目前流行的基于液滴的scRNA-seq系統(tǒng)（如10×Genomics Chromium平臺）的關(guān)鍵策略是利用液滴微流控技術(shù)將單細(xì)胞與唯一的DNA條形編碼珠子共同封裝在液滴中，隨后由珠子上數(shù)十億份唯一的條形編碼poly(T)引物捕獲多聚腺苷酸化的mRNA。

然而，這種策略與細(xì)菌的單細(xì)胞RNA測序并不兼容。其中一個主要原因是細(xì)菌mRNA缺乏3′端poly(A)尾部，而這正是poly(T)引物的捕獲位點。此外，典型細(xì)菌的RNA含量比典型哺乳動物細(xì)胞低兩個數(shù)量級，核糖體RNA（rRNA）占細(xì)菌總RNA的80%以上，這使得在單個細(xì)菌細(xì)胞水平上有效捕獲和區(qū)分這些低含量mRNA變得十分困難，堅韌的細(xì)胞壁也使細(xì)菌難以裂解并釋放液滴中的RNA。

為了解決這些問題，人們開發(fā)了一些相對低通量的單細(xì)菌RNA測序方法，這些方法需要使用單細(xì)胞操縱器或熒光激活細(xì)胞分選術(shù)（FACS）將單細(xì)菌分離到多孔板中。之前開發(fā)的兩種細(xì)菌RNA測序方法“PETRI-seq”和 “microSPLiT”使用隨機反轉(zhuǎn)錄（RT）引物，使研究人員能夠通過分割池條形碼策略同時分析數(shù)千個固定細(xì)菌，這極大地增強了大規(guī)模研究細(xì)菌群落轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性的能力。然而，這種組合式分裂池條形碼策略需要在96孔板中進(jìn)行多次反應(yīng)，而96孔板并不是高通量單細(xì)胞RNA測序的常用或靈敏平臺。此外，即使富集了mRNA，PETRI-seq和microSPLiT中的大部分映射讀數(shù)也是rRNA，這導(dǎo)致了相當(dāng)高的測序成本。

為了解決上述問題，近期，浙江大學(xué)王永成研究員課題組在Nature Communications雜志上發(fā)表了題為“Droplet-based high-throughput single microbe RNA sequencing by smRandom-seq”的研究論文，報告了一種基于液滴的高通量單細(xì)菌RNA測序方法“smRandom-seq”。

在這項工作中，研究人員利用隨機引物原位生成互補DNA（cDNA），利用液滴微流控技術(shù)進(jìn)行單細(xì)菌條形碼編碼，并利用基于CRISPR的rRNA去除法進(jìn)行mRNA富集，在此基礎(chǔ)上開發(fā)了一種高通量、高靈敏度的單細(xì)菌RNA測序方法“smRandom-seq”。

圖1 基于液滴微流控的smRandom-seq測序方法

smRandom-seq具有條形碼效率高、物種特異性高（99%）、交叉污染小（1.6%）和自動化能力強等特點。基于CRISPR的rRNA去除法顯著降低了rRNA百分比（83%-32%）。由于高效的rRNA去除法，大腸桿菌的映射mRNA讀數(shù)高度富集，增加了4倍（16%-63%）。在約8000個大腸桿菌群體中，每個細(xì)菌可檢測到約1000個基因。研究人員還驗證了smRandom-seq可用于其他常見細(xì)菌物種，包括革蘭氏陰性菌（鮑曼不動桿菌、肺炎雙球菌和銅綠假單胞菌）和革蘭氏陽性菌（枯草桿菌和金黃色葡萄球菌）。



圖2 使用參考細(xì)菌樣本驗證smRandom-seq測序方法的可行性

研究人員還發(fā)現(xiàn)大腸桿菌群在抗生素作用下表現(xiàn)出形態(tài)異質(zhì)性，并進(jìn)行 smRandom-seq以研究單個細(xì)菌的這些轉(zhuǎn)錄組變化，smRandom-seq對基因表達(dá)的聚類分析結(jié)果與形態(tài)特征一致。大腸桿菌的一些亞群顯示出不同的SOS響應(yīng)和代謝通路基因表達(dá)模式，這可能是抗生素耐藥亞群。

圖3 利用smRandom-seq測序方法捕獲單個大腸桿菌在抗生素脅迫下的轉(zhuǎn)錄組變化

總之，“smRandom-seq”測序方法提供了一種高通量單細(xì)菌轉(zhuǎn)錄組圖譜分析工具，它將促進(jìn)未來在細(xì)菌耐藥性、持久性、細(xì)菌-宿主相互作用和微生物組研究方面的發(fā)現(xiàn)。





審核編輯：劉清