說到組學研究，可能很多人都會想到基因組、轉錄組、蛋白質組這些耳熟能詳的名字。但這些組學基本圍繞中心法則，從遺傳和基因表達的角度闡釋表型形成的分子機制。然而，隨著生物學研究的不斷深入，我們發現生命法則并不是簡單的線性調控，而是復雜的調控網絡，其中就包括各種類型的化學修飾，修飾組學也逐漸被人所重視。越來越多的研究表明分子修飾可能導致信號通路和基因表達的變化，從而影響表型的形成。因此，為了讓大家能掌握修飾組學的研究思路，小編帶來了一篇上海交通大學薛紅衛教授團隊的文章，以磷酸化蛋白質組為例，解讀修飾組學的研究策略。

01研究背景 蛋白質磷酸化是由蛋白激酶進行的主要翻譯后修飾，構成真核生物中復雜信號網絡的組成部分。CK1（酪蛋白激酶1）在真核生物中高度保守，參與到植物和哺乳動物細胞中的多種信號通路，發揮至關重要的作用。然而，對于CK1的內源性底物研究的特性和廣度還未能全面探索。盡管一些公開數據庫可用于預測底物和磷酸化殘基（磷酸化位點），但體內驗證預測的結果十分困難，局限性大。因此，本研究借助LC+MS/MS DIA精準定量磷酸化蛋白質組的力量，探究AEL介導的磷酸化事件，鑒定新的磷酸化底物motif，并發現AEL（擬南芥的特異性CK1是AEL家族基因，包括AEL1/2/3/4）通過介導轉錄組因子C3H17的磷酸化來調節胚胎發生，促進該轉錄因子的蛋白質穩定性和反式激活活性。此外，研究者預測了水稻、小鼠和人中新的候選 CK1 底物，促進研究 CK1 介導的磷酸化在不同物種中的作用。 02技術路線

為了方便各位老師快速掌握研究思路和結果，小編繪制了文章的研究框架圖，供各位觀賞。

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03研究結果

1. 篩選AEL調控的磷酸化肽段，并鑒定其motif特征

利用LC+MS/MS DIA，對擬南芥野生型、AEL過表達和功能缺失ael突變體進行磷酸化蛋白質組定量檢測及分析，獲得因AEL上調而上調的磷酸化肽段3985條，分布在1032個蛋白質中。利用Motif-X分析這些上調磷酸化肽段，發現4個經典CK1底物motif，并鑒定到4個新的motif。這些結果通過實驗和蛋白質3D結構分析進行驗證。

Fig.1 AEL 磷酸化motif的鑒定和驗證

2. 富集分析發現AEL的功能

為了研究AEL調控的生物學功能，對上述1032個蛋白質和用8個motif在數據庫查找到的3509個預測的AEL底物蛋白進行GO和KEGG富集分析，發現了AEL在轉錄調控、環境脅迫、代謝、細胞分裂、激素響應和營養相關的功能。此外，富集分析結果中發現了與開花時間調控相關的類別，表明AEL可能通過結合不同的翻譯后修飾來調控特定的發育階段。

Fig.2 利用鑒定到的motif預測AEL的底物并進行功能分析

3. 從AEL的底物中挑選與胚胎發育相關的C3H17為了研究蛋白磷酸化對于擬南芥胚胎發育的影響，研究者從上調磷酸化蛋白質中挑選了C3H17（一種 CCCH 型鋅指轉錄因子）繼續研究。該蛋白占據了生殖和胚胎發育相關的多個生物過程交匯處的核心位置，并且其功能缺失突變體表型與ael三重突變體相同，即胚胎發育異常和停滯。4. AEL介導C3H17磷酸化在胚胎發育中至關重要

選定要研究的底物蛋白質后，研究者首先用體內、體外實驗驗證了組學結果，確認AEL可以與C3H17互作。然后，利用Scansite算法和LC-MS/MS技術鑒定出AEL使C3H17磷酸化的兩個氨基酸位點：S492和T585，并在C3H17模擬非磷酸化突變體（C3H17AA）和ael突變體中進行驗證。

接下來，研究者想知道C3H17磷酸化后會發生怎樣的變化。因此，研究者在野生型、AEL突變體、C3H17模擬磷酸化（C3H17DE）和C3H17AA突變體中檢測了C3H17蛋白的降解程度，并發現AEL1-OE和C3H17DE突變體中降解程度低，說明AEL介導的磷酸化抑制了降解，從而增強了C3H17的體內穩定性。此外，C3H17作為轉錄因子調控的三個下游基因CRU3、OLEO1和OLEO2在AEL-OE表達更高，c3h17突變體中表達較低；在C3H17AA突變體中基因轉錄受抑制，而在C3H17DE突變體中基因轉錄活性增加，證實了AEL通過磷酸化促進了C3H17的轉錄激活活性。

最后，研究者想要探究AEL介導C3H17磷酸化后會對擬南芥的發育產生哪些影響。當過表達C3H17，尤其是C3H17DE，能夠拯救ael123中觀察到的胚胎流產表型，而無論在野生型還是AEL突變體中，過表達C3H17AA加劇了胚胎流產，說明AEL通過磷酸化C3H17在胚胎發育中發揮關鍵作用。轉錄組測序的差異基因和富集分析結果進一步證實這一結果。此外，參與細胞分裂、胚胎發育等信號通路的三個基因IPT7、IMD1和NHL6在ael123、c3h17-1和模擬非磷酸化的ael123中的表達受抑制，但在表達C3H17DE的ael123中被誘導，表明這些基因可能在C3H17的下游發揮作用，其功能依賴于C3H17的磷酸化，可能在胚胎發育中發揮重要作用。

Fig.3 AEL介導C3H17磷酸化在胚胎發育中的關鍵作用

5. 預測CK1在植物和哺乳動物中的底物并確認其功能保守性

上述結果在擬南芥中確認了CK1及其底物蛋白在胚胎發育中的重要作用。接下來，研究者打算在不同物種中分析CK1的保守性。從人、小鼠、水稻的蛋白質數據庫中利用鑒定出的8種motif序列進行篩選，獲得了CK1大量的候選底物蛋白。通過GO和KEGG功能富集分析，發現CK1在單子葉和雙子葉植物中具有保守的功能。染色體和染色質組織、細胞分裂過程中的關鍵事件的GO類別在小鼠、人和擬南芥中富集程度高，表明細胞分裂是真核生物中由 CK1 調節的最重要、最保守的生物學機制。這些結果將有助于研究CK1在植物和哺乳動物中的保守功能。

Fig.4 人CK1底物的分子功能

04主要結論

本研究利用LC+MS/MS DIA定量檢測擬南芥中的磷酸化蛋白質組，識別CK1底物和顯著變化的磷酸化肽段，并利用Motif-X鑒定出8個CK1的底物motif，可用于預測 CK1 的候選底物和功能。通過生化和遺傳分析對新鑒定的底物C3H17進行了功能表征，揭示了 AEL 促進的 C3H17 蛋白穩定性和反式激活活性在調節胚胎發生中的作用。由于 CK1 在真核生物中高度保守，研究者使用新鑒定的 CK1 底物motif搜索了水稻、小鼠和人蛋白質數據庫，獲得了比目前已知更多的候選底物，拓展了我們對CK1在植物和哺乳動物中功能的理解，推動CK1介導的磷酸化在不同物種中的機制研究。