實(shí)驗(yàn)名稱：高壓放大器在介電泳效應(yīng)的細(xì)胞分選研究中的應(yīng)用

研究方向：生物醫(yī)學(xué)

測(cè)試目的：

細(xì)胞分選在分析化學(xué)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域有著非常重要的應(yīng)用。在眾多的分選方法中，微流控分選方法以其響應(yīng)速度快、樣品需求少等優(yōu)點(diǎn)成為研究熱門。微流控細(xì)胞分選法可分為被動(dòng)分選法和主動(dòng)分選法。被動(dòng)分選法對(duì)待分選細(xì)胞的性質(zhì)無(wú)要求，且無(wú)需預(yù)標(biāo)記，對(duì)芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)及加工要求較高，且容易出現(xiàn)過(guò)濾結(jié)構(gòu)被堵塞等問(wèn)題。主動(dòng)分選法分選效率高，但對(duì)待分選的細(xì)胞通常有特殊要求，且大多需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)標(biāo)記等處理，嚴(yán)重影響細(xì)胞活性。

結(jié)合被動(dòng)分選法和主動(dòng)分選法的優(yōu)點(diǎn)，本文提出一種基于微結(jié)構(gòu)過(guò)濾法和介電電泳效應(yīng)的新型細(xì)胞分選方法。該方法在一定程度上克服了單一分選方法的弊端，有望解決微結(jié)構(gòu)過(guò)濾法普遍存在的堵塞問(wèn)題。具體實(shí)現(xiàn)方式是在微過(guò)濾結(jié)構(gòu)區(qū)域集成微電極，通過(guò)調(diào)節(jié)過(guò)濾結(jié)構(gòu)幾何參數(shù)和加載的交流信號(hào)參數(shù)，誘導(dǎo)形成可以驅(qū)動(dòng)細(xì)胞往低場(chǎng)強(qiáng)區(qū)域運(yùn)動(dòng)的負(fù)向介電電泳效應(yīng)，進(jìn)而避免待分選細(xì)胞在過(guò)濾孔區(qū)域的堵塞。

測(cè)試設(shè)備：ATA-2042高壓放大器、函數(shù)信號(hào)發(fā)生器、蠕動(dòng)泵、筆記本電腦、科研級(jí)攝像頭、倒置熒光顯微鏡、單反相機(jī)等。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：

①樣品溶液配制

使用非生物類樣品和生物類樣品來(lái)驗(yàn)證所設(shè)計(jì)多級(jí)化分選微流控裝置。非生物類樣品選用37μm、16.3μm和9.7μm三種尺度不同的微粒混合而成，使用PBS緩沖液調(diào)節(jié)其濃度到104~105/mL水平；為防止微粒之間相互黏附以及微粒和芯片之間的黏附，在緩沖液內(nèi)加入0.1%v/v濃度的Tween20。實(shí)驗(yàn)中使用的PBS緩沖液濃度為1mM，即10%濃度的PBS緩沖液，其電導(dǎo)率為0.17S/m，較低的電導(dǎo)率可以在一定程度上減少實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所產(chǎn)生的焦耳熱效應(yīng)，降低其對(duì)待分選的樣品活性的影響。

生物類樣品選擇了雨生紅球藻和片球藻的混合懸液。兩種藻類均培養(yǎng)于BG11培養(yǎng)基。取適量雨生紅球藻和片球藻混合在一起，細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至104~105/mL水平。需要注意的是，由于藻類密度較大，在初步的預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其極易沉底，在進(jìn)樣口處形成堆積，且在微流控芯片內(nèi)部流動(dòng)性較差，因此在每毫升混合藻細(xì)胞懸液中加入0.4g山梨醇。

②實(shí)驗(yàn)平臺(tái)搭建

圖：實(shí)驗(yàn)平臺(tái)

在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，要按實(shí)驗(yàn)需求搭建實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。上圖所示所示為搭建好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。芯片出口通過(guò)導(dǎo)管與蠕動(dòng)泵相連接。蠕動(dòng)泵向外抽取液體，在芯片內(nèi)形成負(fù)壓，以此驅(qū)動(dòng)待分選微粒或藻細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。信號(hào)發(fā)生器與電壓放大器相連后通過(guò)導(dǎo)電膠布與ITO電極連通，為芯片提供所需激勵(lì)信號(hào)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程的現(xiàn)象和數(shù)據(jù)采用單反相機(jī)與倒置顯微鏡相結(jié)合的觀測(cè)手段來(lái)獲取，實(shí)現(xiàn)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的實(shí)時(shí)觀察和記錄。

③芯片預(yù)處理

在注入實(shí)驗(yàn)樣本之前，需要對(duì)芯片進(jìn)行預(yù)處理。在微粒分選實(shí)驗(yàn)中，在芯片入口處加載不含微粒的10%PBS緩沖液；在藻細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)中，在芯片入口處加載不含細(xì)胞的BG11培養(yǎng)液。在芯片毛細(xì)作用和親水性的共同作用下，緩沖液會(huì)快速充滿整個(gè)芯片通道。打開(kāi)蠕動(dòng)泵，設(shè)置抽取速度為1mL/min，并抽取5分鐘。該步驟的目的是完全消除芯片內(nèi)的氣泡，防止氣泡影響微粒的運(yùn)動(dòng)軌跡以及避免實(shí)驗(yàn)中氣泡可能造成的電極電解問(wèn)題。

④滴加樣品

使用移液器吸取50μL實(shí)驗(yàn)樣本，加載于芯片入口處。在蠕動(dòng)泵誘導(dǎo)的負(fù)壓作用下，上述樣品會(huì)在微流控芯片內(nèi)向出口處流動(dòng)。

⑤加載信號(hào)

開(kāi)啟信號(hào)發(fā)生器和電壓放大器，加載交流信號(hào)于ITO電極上。調(diào)節(jié)信號(hào)頻率和幅值，優(yōu)化分選效率。

⑥實(shí)驗(yàn)記錄

打開(kāi)單反相機(jī)，記錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

圖：37μm、16.3μm和9.7μm微粒的分選過(guò)程（A1-A4）第一級(jí)過(guò)濾級(jí)分選效果；（B1-B4）第二級(jí)過(guò)濾級(jí)分選效果

第一級(jí)過(guò)濾級(jí)分選情況如上圖A1~A4所示，16.3μm微粒和9.7μm微粒不斷的通過(guò)微柱間距為25μm的第一級(jí)，而37μm的微粒在介電電泳力的作用下，一直在過(guò)濾孔附近運(yùn)動(dòng)，并沒(méi)有直接堵塞住過(guò)濾孔。當(dāng)微粒運(yùn)動(dòng)到第一級(jí)過(guò)濾結(jié)構(gòu)（過(guò)濾孔大小為25μm）附近時(shí)，直徑37μm、16.3μm、9.7μm的三種微粒會(huì)呈現(xiàn)出不同的受力及運(yùn)動(dòng)狀態(tài)：直徑37μm的微粒因大于過(guò)濾柱間的過(guò)濾孔尺度，必然不能通過(guò)該過(guò)濾級(jí)。該微粒在流向過(guò)濾孔的過(guò)程中，電場(chǎng)梯度不斷增大（兩微柱間過(guò)濾孔區(qū)域?yàn)樽畲箅妶?chǎng)強(qiáng)度梯度區(qū)域），所受負(fù)向介電電泳力nDEP也隨之增強(qiáng)，在曳力和nDEP作用下，微粒的運(yùn)動(dòng)速度會(huì)降低，并繼續(xù)保持向過(guò)濾孔區(qū)域運(yùn)動(dòng)。此時(shí)，微粒所受nDEP力進(jìn)一步增強(qiáng)，直至能夠抵消細(xì)胞所受的曳力，達(dá)到受力平衡態(tài)。但微粒會(huì)繼續(xù)在慣性作用下向過(guò)濾孔區(qū)域運(yùn)動(dòng)，此時(shí)，在進(jìn)一步增強(qiáng)的nDEP效應(yīng)下，微粒會(huì)被反向推離過(guò)濾孔區(qū)域。上述過(guò)程會(huì)反復(fù)進(jìn)行，微粒會(huì)在此處呈現(xiàn)出振蕩狀態(tài)，運(yùn)動(dòng)往復(fù)軌跡不斷減小，直至達(dá)到相對(duì)平衡狀態(tài)，從而在過(guò)濾孔區(qū)域形成聚集而不堵塞過(guò)濾孔的分布態(tài)勢(shì)，避免傳統(tǒng)微結(jié)構(gòu)過(guò)濾分選易出現(xiàn)過(guò)濾孔被微粒堵塞的情形發(fā)生。

第二級(jí)過(guò)濾級(jí)分選情況如上圖B1~B4展示，部分9.7μm到達(dá)過(guò)濾孔附近能夠立馬穿過(guò)過(guò)濾孔，其余9.7μm微粒會(huì)先在過(guò)濾孔附近聚集，然后連成串一起過(guò)去。當(dāng)16.3μm和9.7μm的微粒運(yùn)動(dòng)到第二級(jí)過(guò)濾級(jí)附近時(shí)，由于第二級(jí)過(guò)濾級(jí)的過(guò)濾柱的結(jié)構(gòu)效應(yīng)，其電場(chǎng)梯度較第一級(jí)更強(qiáng)，直徑16.3μm的微粒形成的nDEP及曳力聯(lián)合作用下，使其呈現(xiàn)出與直徑37μm微粒在第一級(jí)過(guò)濾級(jí)相似的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，在第二級(jí)過(guò)濾級(jí)的過(guò)濾孔區(qū)域呈現(xiàn)堆積而不堵塞過(guò)濾孔的分布。同時(shí)，因尺度效應(yīng)受nDEP較小的9.7μm的微粒流通過(guò)兩微柱間的過(guò)濾孔進(jìn)入后續(xù)結(jié)構(gòu)。

在不加載正弦激勵(lì)信號(hào)情況下，芯片很快就會(huì)因?yàn)檫^(guò)濾孔被堵塞而不能工作。本文在通過(guò)集成ITO微電極，借助負(fù)向介電電泳效應(yīng)較好地解決了傳統(tǒng)微結(jié)構(gòu)過(guò)濾法存在的堵塞問(wèn)題，能夠在很大程度上改善芯片的分選通量。

安泰ATA-2042高壓放大器：

圖：ATA-2042高壓放大器指標(biāo)參數(shù)

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