最近，一支來自北美和歐洲的科學家團隊開發了一種創新的生長和成像平臺，稱為 GLO-Roots，可以研究土壤生長植物的根系結構和基因表達。

GLO-Roots是卡內基科學研究所(加利福尼亞州斯坦福)的 José Dinneny 博士實驗室、Rubén Réllan-álvarez 博士(墨西哥朗格比奧)和比利時列日大學的 Guillaume Lobet 博士實驗室的合作成果。研究人員在 BioImaging Solutions, Inc.(加利福尼亞州圣地亞哥)的幫助下設計和建造了新的生長和成像平臺，支持幾種模式生物，即擬南芥、二穗短柄草、狗尾草和番茄。

GLO-Roots 采用基于發光的報告子和一對普林斯頓儀器背照式 CCD 相機，用于研究土壤中生長的遮光根的根結構和基因表達模式。定制設計的圖像分析算法允許對土壤特性、基因表達和根系結構特征進行空間整合。GLO-Roots 開發人員聲稱，新平臺可以提供巨大的實用性，以喚起自然的適應性反應的方式向根系呈現環境刺激，并提供研究此類過程多維性質的工具。

本應用說明將概述 GLO-Roots 團隊進行的一些研究，該團隊由斯坦福大學卡內基科學研究所植物生物學系的 José Dinneny 博士領導

GLO-Roots 設置

GLO-Roots 平臺由 四部分組成：(1)生長容器，稱為根管，允許植物在土壤中生長并對根部進行成像;(2)基于發光的報告器，可以追蹤活植物根部生物學的各個方面;(3) GLO1，一種旨在自動對根管進行成像的發光成像系統; ( 4 ) GLO-RIA，一種旨在量化利用 GLO1 成像的根系的圖像分析套件。2圖 1 顯示了使用 GLO-Roots 平臺的實驗設置示例。

圖 1. GLO-Roots 生長和成像系統。(A)根管不同物理組件的三維表示，包括塑料蓋、聚碳酸酯板、墊片和橡膠 U 型通道。(B)根管中 35 天大的植物，黑色蓋子已移除。(C)帶有 11 個根管的容納箱的頂視圖。(D)本研究中使用的不同熒光素酶的體內發射光譜。表達所示轉基因的轉基因純合株系在瓊脂培養基上生長 8 天。將熒光素 (300 μM) 噴灑在幼苗上;將培養皿放在黑暗中，然后在 500 至 700 nm 的波長范圍內成像 2 秒。從不同幼苗根部的不同部位獲取五個強度值并取平均值。相對比較大強度值顯示在右下圖中。(E) GLO1 成像系統由兩臺Princeton Instruments PIXIS:2048 背照式 CCD 相機 (a)組成，冷卻至 -55°C。濾光輪(b)允許對不同的熒光素酶進行光譜分離。右側是根管支架(c)用于將根管器定位在攝像機前面。步進電機(d)將根管器旋轉 180° 以對兩側進行成像。(F)在根管器的兩側分別對表達報告基因 ProUBQ10:LUC2o 的 21 DAS(即播種后 21 天)植物進行成像;發光信號以綠色或洋紅色表示側面。面板中間顯示了兩側的組合圖像。插圖顯示了根系的放大部分。

圖表、照片和數據由卡內基科學研究所的 José Dinneny 博士提供。首次發表于 R. Rellán-álvarez 等人 2015 年。“GLORoots：一種能夠多維表征土壤生長根系的成像平臺。”eLife 4 (1): e07597。

雖然大多數用于生物醫學研究的商用發光成像系統都針對水平放置的標本或微量滴定板中的樣品進行了優化，但將根管置于此位置會引發植物的重力反應。因此，GLO-Roots 使用定制設計的成像系統(稱為生長和發光觀測站 1，或簡稱為 GLO1)，該系統已針對GLO-Roots 根管中的雙報告熒光素酶表達進行了優化。

兩臺PIXIS:2048 背照式 CCD 相機(來自普林斯頓儀器公司)相互疊放，以便捕捉根管的部分重疊圖像，同時電動平臺自動旋轉根管以捕捉兩側的圖像(參見圖 1E)。然后根據捕捉到的兩側圖像生成合成圖像。圖 1F 顯示，每側大約有一半的根系顯露出來，兩側都有一些根系可見。土壤層足夠厚，可以阻擋部分根系的光線，但又足夠薄，可以確保其連續結構可以從對面視圖進行編譯。整個 GLO1 成像系統封閉在一個不透光的黑匣子中，該黑匣子配有門，可以裝載和卸載根管。

PIXIS:2048B 相機不僅為 GLO-Roots 研究人員提供了所需的空間分辨率和視野，還提供了檢測所用不同報告基因的發射波長所需的出色低光照靈敏度。表 1 列出了用于擬南芥相關 GLO-Roots 研究的熒光素酶。

數據和結果

根系會發育出不同的根系類型，每種根系都能感知無數的局部環境線索，并將其環境信息與系統信號整合在一起。這種高度復雜的多維輸入融合使得根系生長速度、方向和代謝活動能夠不斷調整，從而形成一個動態的物理網絡。

圖 2 展示了使用 GLO1 系統捕獲的擬南芥根系的延時成像以及使用 GLO-RIA 圖像分析套件進行的量化。

圖 2. 擬南芥根系延時成像并使用 GLO-RIA 進行量化。(A)ProUBQ10:LUC2o Col-0 植物的典型每日延時圖像系列(11 至 35 DAS)。(B)使用 GLO-RIA 中實現的方向性插件計算出按時間序列成像的三個根系的平均方向性(如圖 A 所示)。(C)使用圖 A 中的圖像對根系生長進行顏色編碼投影。(D)根系深度、寬度和面積是根據凸包自動計算的，凸包由 GLO-RIA(n = 3)半自動確定。手動量化了主根長度、側根數以及側根數除以主根長度。使用具有 95% 置信區間(灰色)的局部多項式回歸擬合來表示方向性分布曲線。0° 是重力矢量的方向。

圖表、照片和數據由卡內基科學研究所的 José Dinneny 博士提供。首次發表于 R. Rellán-álvarez 等人 2015 年的論文“GLORoots：一種能夠多維表征土壤中生長的根系的成像平臺。”eLife 4 (1): e07597。

在這里，可以通過植物發育的后期階段觀察到方向性等根系特征(注意圖 2A 和 2B 中分別顯示的 35 DAS 根系圖像和 35 DAS 方向性分析)。圖 2A 和圖 3 顯示了播種后11 至 21 天的擬南芥種質 Col-0 根表達報告基因 ProUBQ10:LUC2o 的時間序列;圖 2C 顯示了顏色編碼的時間投影。

方向性分析表明，隨著側根成為主要根系類型，根系角度逐漸變化，從 0°(垂直)到 55°。圖 2D 顯示了GLO-RIA 可以自動捕獲的幾種根系特征(深度、寬度、面積)以及手動量化的其他特征(主根生長率或每個主根的側根數量)隨時間的變化。

到目前為止，GLO-Roots 團隊已經發表了關于根系生長連續成像的數據;不同擬南芥種質的根系結構;利用光譜上不同的熒光素酶來捕獲與基因表達模式、根系相互作用表征和微生物定植相關的其他信息;在缺水、缺磷和光照條件下根系結構的適應性變化; GLO-Roots 平臺是否適合研究其他植物物種;等等。研究團隊還對發現其他環境刺激如何影響根系生長以及這些反應在擬南芥不同種質之間是否不同非常感興趣。

圖 3：在對照條件下生長的表達 ProUBQ10:LUC2o 的 Col-0 植物從 11 天到 21 天的視頻延時時間戳。視頻由卡內基科學研究所的 José Dinneny 博士提供。首次發表于 R. Rellán-álvarez 等人 2015 年。“GLO-Roots：一種能夠多維表征土壤生長根系的成像平臺。”eLife 4 (1): e07597。

欲了解更多數據和深入討論結果，請參閱 R. Rellán-álvarez 等人 2015 年的論文“ GLO-Roots：一個能夠多維表征土壤中生長的根系的成像平臺。 ”eLife 4 (1): e07597。

使能技術

GLO1 成像系統中集成的每臺PIXIS:2048 相機均采用背照式傳感器 CCD，其大型感光陣列由2048 x 2048 像素組成(見圖 3)。通過采用普林斯頓儀器獨有的XP 冷卻技術，這些四百萬像素相機通過全金屬密封設計實現了低至 -70°C 的熱電冷卻。這種創新的冷卻技術可確保免維護運行 ，并由業內唯一的終身真空保證提供支持。

圖 4：普林斯頓儀器公司的 PIXIS：2048 CCD 相機具有出色的靈敏度和寬闊的視野。

除了 XP 有助于很大程度地減少熱產生的(暗)噪聲外，極高的量子效率和超低噪聲電子元件使 PIXIS:2048 相機成為要求嚴格的低光照成像應用的理想選擇。雙速操作(即 100 kHz 或 2 MHz)允許在穩態和快速動力學研究中使用。

為了優化從 UV 到 NIR 應用的定量科學成像性能，PIXIS:2048 平臺支持前照式CCD 格式、背照式格式、具有高 UV 靈敏度的背照式格式以及具有高 NIR 靈敏度的背照式格式(請注意，普林斯頓儀器利用其專有的eXcelon? 處理和背照式深耗盡技術，在 NIR 中提供比較高靈敏度，同時抑制標準背照式 CCD 中發生的 etaloning)。PIXIS 系列支持其他幾種適用于各種成像和光譜應用的 CCD 陣列尺寸。

使用普林斯頓儀器公司最新版的 64 位 LightField? 數據采集軟件(可選)可以輕松完全控制所有 PIXIS 硬件功能。通過極其直觀的 LightField 用戶界面，可以實現一系列新功能，輕松捕獲和導出圖像數據。

審核編輯 黃宇