透射電子顯微鏡(TEM)是研究材料微觀結構的重要工具,其樣品制備是關鍵步驟，本節旨在解讀TEM樣品的制備方法。

透射電子顯微鏡(TEM)是研究材料微觀結構的重要工具,其樣品制備是關鍵步驟。 以下是TEM樣品制備的主要技術：

1.機械研磨和離子濺射：將樣品機械研磨成極薄片,再通過離子濺射進一步變薄至電子穿透可見。適用于硬質材料。

2.聚焦離子束(FIB)加工：利用聚焦離子束對樣品表面進行精密切割和薄膜制備,制備出厚度均勻的電子透射薄膜。適用于各種材料。

3.超薄切片技術：將樣品先用樹脂包埋固定,然后用超薄切片機切出厚度僅幾十納米的超薄切片。適用于生物樣品和軟質材料。

4.電化學拋光技術：利用電化學原理在樣品表面進行局部溶蝕,制備出具有特殊形貌的電子透射薄膜。適用于金屬和合金材料。

綜上所述,不同的TEM樣品制備技術適用于不同類型的材料,關鍵在于根據材料特性選擇合適的制備工藝。制備高質量的TEM樣品是開展材料微觀結構表征的基礎。

TEM樣品載網

樣品載網有不同的形狀和材料，最常用和最便宜的是銅網，它們的外徑通常為3毫米，并有多種篩孔尺寸可供選擇。

載網中間有一個大孔，需要覆蓋一層電子透明薄膜。粉末最常用的薄膜是碳膜或孔狀碳膜。這些薄膜對電子幾乎是透明的，因此只需很少的樣品制備工作就能輕松觀察粉末樣品。雖然這些薄膜可以在實驗室制作，但大多數實驗室都會購買預制的薄膜以滿足自己的特殊要求。

圖1 在TEM中用于固定試樣的銅網和樣品桿

除了保留樣品原生狀態下的形態和成分這一目標之外，樣品制備的主要考慮因素是獲得足夠薄的切片，以便電子束能夠穿過整個樣品并從另一側射出。

樹脂聚合物用于支撐樣品：比如柔軟的生物、聚合物、粘土或微粒，通常在切片前嵌入樹脂聚合物中。樹脂聚合物必須堅硬，且有一定彈性，可以支撐樣品并能從樣品塊中取出薄片（如70nm厚薄片）。如果樣品是冷凍的，則無需在切片前進行樹脂包埋。

天然硬質材料也可以通過其他方法制成薄片，例如切割小塊，然后將中心區域凹陷、研磨、拋光或用離子束減薄。這樣制作出的薄片無需進一步支撐。但這些工藝通常只用于熱穩定或無機硬質材料，如金屬和陶瓷。

微顆粒可以懸浮在溶劑中，直接放置在支撐膜上。

圖2 一個制備不好的試樣，只有一小部分透射。熱軋鎂試樣，使用明場 STEM 模式成像。

有機類樣品制備方法

有機類和生物類樣品在TEM制備中有以下一些特點: 1結構敏感性：有機及生物樣品通常較為脆弱,很容易在制樣過程中受到損壞。需要特殊的固定、浸漬和脫水方法來保護樣品結構。2水含量高：這類樣品大多含有大量的水分子,需要經過脫水處理才能制備出真空下穩定的薄膜。3.低襯度：生物大分子如蛋白質、核酸等原子序數低,在電鏡下對比度較低,需要使用染色或其他增強手段。4制樣困難：由于組織脆弱和含水量高,采用切片等機械手段制備薄膜很容易造成切片變形或斷裂。需要更精細的微切方法。5.電子束敏感：這類樣品在電子束輻射下很容易發生結構破壞或化學反應,需要控制電子束強度和照射時間。6.取樣要求高：需要從復雜的生物樣品中精確地切割出感興趣的區域進行觀察,操作難度大。

總之,有機和生物類樣品由于其結構脆弱、含水量高等特點,TEM制樣需要更加復雜精細的處理方法。樣品制備是觀察這類樣品的關鍵步驟。

對于生物類樣品，有三種主要的樣品制備方法可以保存細胞結構并增強襯度。它們是：低溫固定法、化學固定法和負染色法。

選擇哪種技術處理樣品取決于樣品的性質、研究的目的以及設備類型。如果需要標記以精確定位蛋白質的樣品（免疫標記），或需要切成薄片以觀察固有形態的樣品，就需要不同的方案。如果只想看到樣品的輪廓或表面形狀，則需要負染色技術。

無機類樣品制備方法

無機類硬質樣品在TEM制備中有以下幾個主要特點:

1高硬度和脆性:無機材料如金屬、陶瓷等通常更硬且更脆。2制樣困難:由于硬度高,很難采用切片等機械手段制備出均勻、無損的薄膜樣品。需要采用離子轟擊、機械研磨等更復雜的制備方法。3電子束輻射敏感:一些無機材料在電子束照射下會發生結構變化或破壞。需要優化電子束強度和樣品厚度等參數。4.厚度控制困難:由于硬度高,很難精確控制樣品厚度達到TEM觀察的最佳范圍(通常20-100 nm)。需要多次嘗試優化。5.取樣難度大:有時需要從塊狀樣品中切割出合適的薄片區域進行觀察,這對取樣位置的選擇提出了很高要求。

總之,無機硬質樣品的TEM制備需要更專業的技術和經驗,操作過程更加復雜和困難。掌握適合的制備方法是重要的。

粉末

散裝易碎材料需要先粉碎成小顆粒或粉末，然后再放到樣品載網上，這可以通過使用小的瑪瑙杵和研缽來實現，在材料上來回搖動研杵，使其破碎。碾碎成細粉后，粉末顆粒需要分散，然后再滴到載網或支撐膜上。為此，可將粉末加入乙醇等溶劑中，然后在密閉的小瓶/容器中進行短時間（如 30 秒至幾分鐘）的超聲處理。然后用移液管將一滴懸浮材料滴到載網/支撐膜上，顆粒沉降到載網表面，在TEM中觀察之前必須讓溶劑完全揮發。 大塊材料

堅硬的金屬樣品可以用金剛石鋸片切割成薄片。鋸片切割時，會沿切割邊緣噴灑液體作為潤滑劑并減少熱量。使用這種鋸片將是 TEM 樣品制備過程的開始，因為鋸片無法切割出足夠薄的樣品以供觀察。它們需要進一步變薄。

圖3塊狀樣品TEM制備傳統制備流程

1 超聲波圓盤切割

使用超聲波圓盤切割器從切片樣品中切割出一個 3 毫米的圓盤。管狀刀片利用振動向下切割樣品，如果切割后圓盤沒有留在原位，就會從切割管內彈出。然后，圓盤需要通過機械研磨或凹陷來減薄。

安裝樣品以準備切割圓盤可能需要將切片粘在金屬板上。可以使用低溫熔點蠟，然后加熱去除。將金屬底座放在約70攝氏度的熱板上，涂上少量蠟，使其熔化。從熱板上取下支架，立即將樣品放在支架表面融化的蠟上。也可以用磁力將金屬底座吸附到超聲波圓盤刻刀板上。

將所需區域對準切割工具。在樣品上放少量切割介質。將切割工具降至樣品表面，用移液管或注射器將粉末潤濕，開始切割。

當圓盤完全切過樣品切片后，提起切割工具，取下樣品板，在熱板上再次加熱金屬板，取出樣品。

2 機械拋光和電拋光

有多種拋光方法：機械拋光、超聲波拋光、化學拋光和電拋光。

機械拋光也可以通過手工拋光來實現。將樣品安裝在三腳架拋光機上，拋光機的表面可以在砂粒浸漬的圓盤上做掃動和旋轉運動。樣品的位置可以通過千分尺螺釘在支架上進行調整。

可以在布盤上裝載金剛石膏或其他磨粒。標準的做法是，隨著拋光的逐步完善，使用較小等級的磨粒。這樣做的目的是使表面光滑如鏡，沒有劃痕。培養良好的拋光技能需要投入大量時間。

電拋光技術只適用于金屬樣品。它使用一個溫度可控的浴槽和一股電流。浴槽充當電解質。它通常是一種濃酸或酸的混合物。陽極和陰極浸入電解液中。陽極（待拋光樣品）連接到直流電源的正極，陰極連接到負極。陽極表面的金屬被氧化并溶解在電解液中。拋光過程的工作原理是首先去除較高的形貌。

3釘薄Dimpling

對圓盤中心進行減薄稱為"釘薄"或"凹陷研磨"。這種技術可以將一些樣品減薄到足以觀察的程度，但更常用于預減薄到接近電子透明的程度，這樣可以大大減少后期離子研磨的時間，并防止減薄不均勻。

塊狀樣品應從兩面進行凹凸處理（釘薄輪）。如果樣品的相關區域位于一個表面上（例如基底上的薄膜），則應只從"背面 "進行點凹加工。在開始點凹之前，先測量樣品的初始厚度，以確定何時點凹足夠深。

使用磨料粉來減薄樣品圓片。隨著薄化的進行,應使用粒度越來越小的磨料。當下一個更小粒度的磨料去除的厚度約為當前磨料粒度的3倍時,效果最佳。最后一步可用于制造無劃痕的鏡面。

理想情況下，成品圓盤的邊緣厚度應為300 μm，中心厚度應小于10 μm。單面凹痕的邊緣厚度應為150 μm。

需要經常停止研磨過程，并使用刻度盤上的微米刻度檢查凹痕的深度。通常情況下，如果中心位置破了，那么樣品將失去作用，需要重新開始制程。

4 離子束減薄

離子束減薄用于輕柔地去除試樣上的材料，而不會造成損壞。這一過程通常被稱為精密離子拋光。一束離子（通常為氬離子）射向試樣圓盤的中心。離子束以淺角度（通常約 5°）射向試樣。如果試樣已通過凹陷研磨預先變薄，則離子拋光會進一步使試樣變薄，直至形成穿孔。如果試樣沒有經過凹陷研磨，則仍可使用 PIP 研磨試樣的整個厚度，但在某些情況下，這需要的時間太長，因此并不可行。因此，用于離子拋光的試樣厚度通常小于100微米。

5 聚焦離子束（FIB ）銑削

聚焦離子束（FIB）可用于通過非機械方法制備用于 TEM 的薄樣品。一些樣品可以用FIB相對快速地切割，不到一個小時就可以制備好。

需要使用FIB技術的材料包括：1.需要薄橫截面進行觀察，但因硬度太高而無法使用超薄切片技術刀的硬樣品。2.需要精確定位（至 20 納米）制備樣品的樣品。3.會被機械切割、研磨或拋光損壞的材料。 FIB制備TEM樣品是一種高效而精準的方法,具有以下優勢：

1.精細取樣能力：FIB可以精確地從復雜的樣品表面切割出極小區域(通常幾十微米大小)進行觀察,取樣精度高。

2.無需復雜制備：相比傳統的超薄切片法,FIB直接從原始樣品表面"切出"薄膜,免去復雜的樹脂包埋、超薄切片等步驟。

3.制樣時間短：整個FIB制樣過程可以在即使分鐘到幾個小時內完成（取決于樣品）,大大縮短了樣品制備周期。

4.適用于多種樣品：FIB可以用于金屬、陶瓷、半導體、生物等各種硬質無機樣品的制備。

5.原位觀察能力：FIB制樣可以直接在SEM內部完成,實現了原位觀察。

6.靈活性高：FIB制樣過程可以根據需求進行實時調控和優化。

總之,FIB制備TEM樣品是一種高效、精準的方法,是材料分析中不可或缺的重要手段。

制樣產生的假象

在TEM樣品中經常發現假象。這可能是最初選擇樣品時出現的問題，也可能是在制備過程中產生的。TEM的成像目的是觀察一個沒有假象的樣品，所以能夠識別假象并確定其原因是非常重要的。 假象可能來自幾個來源。例如，在離子研磨/細化過程中，氬離子可能被注入到樣品中，這可能導致非晶化和相變。這是由于使用過高的加速電壓導致高能離子損壞樣品造成的。此外，化學制備程序也可能會在樣品上留下污染物。不良的機械拋光會產生不均勻的表面和劃痕，留下殘留物或在樣品中引入位錯。如果樣品超聲處理時間過長或選擇了錯誤的溶劑，即使是樣品載網上的顆粒制備也會產生假象。當使用低溫技術時，樣品必須能夠在不損害結構的情況下耐受低溫。

對于生物樣品，固定會引入假象。由于采集樣品和固定之間間隔時間過長，可能會導致樣品降解。如果固定溶液與樣品條件不匹配，就會發生滲透損傷。固定步驟之間的不良清洗會導致沉淀樣品中出現“胡椒狀pepper”。

冷凍固定也有與樣品厚度和太慢的冷卻速度相關的假象。脫水和樹脂滲透會導致假象。脫水過快會導致收縮假象。樹脂滲透和聚合不良會導致樣品中出現孔洞。

材料的超薄切片引入了另一組可能的假象:撕裂、擠壓或劃痕。

此外，樣品染色會導致表面沉淀。在檸檬酸鉛染色過程中，即使對樣品呼吸過重，也會導致碳酸鉛沉淀。設備(鑷子)和工作臺不清潔會導致油和污染物停留在樣品表面。 最后，在TEM樣品觀察中，如果電子束或等離子體過快地聚集到樣品上，也會損壞樣品或載網上的薄膜，這個問題非常重要。具體表現有以下幾個方面:

1樣品表面損壞：電子束的高能量聚焦會導致樣品表面產生局部過熱和熔融。這種效應會嚴重破壞樣品的結構和形貌,有時甚至會導致樣品完全蒸發。對于一些敏感的有機樣品或生物樣品來說,這種損傷會尤其嚴重。

2載網薄膜破壞：如果等離子體在清洗的時候過于集中,也會損壞載網上的超薄碳膜或其他薄膜。薄膜破裂或穿孔會導致樣品丟失,或者觀察區域受到嚴重干擾。

3.成分變化：高能量照射還可能引起樣品的化學組成變化,如氧化還原反應等。

這種成分變化會導致樣品的物理化學特性發生改變,影響觀察結果的準確性。

4.分辨率降低：局部過熱損壞會造成樣品表面形貌的粗糙化,降低了TEM觀察的分辨率。

為了避免這些問題,在TEM樣品觀察時需要合理調整電子束或等離子體的照射參數,如電壓、電流密度、照射時間等,盡量減少樣品受損。同時還可以采用低溫、低劑量等特殊技術手段來保護樣品。只有樣品結構和成分完整,才能獲得可靠的TEM觀察結果。