熒光分光光度計(jì)概要

　　熒光分光光度計(jì)是用于掃描液相熒光標(biāo)記物所發(fā)出的熒光光譜的一種儀器。其能提供包括激發(fā)光譜、發(fā)射光譜以及熒光強(qiáng)度、量子產(chǎn)率、熒光壽命、熒光偏振等許多物理參數(shù)，從各個(gè)角度反映了分子的成鍵和結(jié)構(gòu)情況。通過對這些參數(shù)的測定， 不但可以做一般的定量分析， 而且還可以推斷分子在各種環(huán)境下的構(gòu)象變化， 從而闡明分子結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。熒光分光光度計(jì)的激發(fā)波長掃描范圍一般是190~650nm，發(fā)射波長掃描范圍是200~800nm?？捎糜谝后w、固體樣品（如凝膠條）的光譜掃描。

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　　熒光分光光度計(jì)分類

　　熒光光譜法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、用樣量少、方法簡便、工作曲線線形范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，可以廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)和藥理學(xué)、有機(jī)和無機(jī)化學(xué)等領(lǐng)域。

　　熒光分光光度計(jì)的發(fā)展經(jīng)歷了手控式熒光分光光度計(jì)，自動(dòng)記錄式熒光分光光度計(jì)，計(jì)算機(jī)控制式熒光分光光度計(jì)。

　　光分光光度計(jì)三個(gè)階段;熒光分光光度計(jì)還可分為單光束式熒光分光光度計(jì)和雙光束式熒光分光光度計(jì)兩大系列。其他的還有低溫激光Sh p ol’skill熒光分光光度計(jì)，配有壽命和相分辯測定的熒光分光光度計(jì)等。

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　　熒光分光光度計(jì)操作步驟

　　1.開機(jī)：接通電源，打開主機(jī)開關(guān)，點(diǎn)燃（打開）光源后，根據(jù)說明書要求啟動(dòng)計(jì)算機(jī)。

　　2.檢測前準(zhǔn)備：參照儀器說明書，在20天內(nèi)至少進(jìn)行一次激發(fā)校準(zhǔn)和發(fā)射校準(zhǔn)，檢測前儀器應(yīng)預(yù)熱。

　　3.工作條件的選擇：環(huán)境溫度應(yīng)在20℃±5℃;相對濕度不大于70%;電源穩(wěn)定，無磁場、電場干擾。根據(jù)樣品的特性及熒光強(qiáng)度，選擇合適的儀器工作條件（如狹縫、PM增益、響應(yīng)時(shí)間等）。

　　4.基本測定

　?。?）熒光激發(fā)光譜測定

　　設(shè)置儀器參數(shù)，掃描發(fā)射波長，找到maxλem，以此為發(fā)射波長，記錄發(fā)射強(qiáng)度作為激發(fā)波長的函數(shù)，便得到激發(fā)光譜。

　　（2）熒光發(fā)射光譜測定

　　設(shè)置儀器參數(shù)，掃描激發(fā)波長，找到maxλex，以此為激發(fā)波長，記錄發(fā)射強(qiáng)度與發(fā)射波長間的函數(shù)關(guān)系，便得到熒光發(fā)射光譜。

　?。?）差譜測定

　　設(shè)置儀器參數(shù)，選擇合適的工作方式，測定背景溶液的發(fā)射光譜并儲(chǔ)存起來，在一定的工作方式下，掃描樣品溶液的發(fā)射波長，得到當(dāng)時(shí)的光度值和儲(chǔ)存的背景值之間的差示值，即差譜。

　　（4）峰面積積分

　　選擇適當(dāng)?shù)墓ぷ鞣绞?，對樣品溶液進(jìn)行積分操作，即得到峰面積積分。

　?。?）熒光強(qiáng)度

　　選擇合適的測量參數(shù)，設(shè)置λex、λem，采用定點(diǎn)讀數(shù)或掃描方式，即可測得所選波長處的熒光強(qiáng)度。

　?。?）定量測定

　　配制一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在一定的測定條件下，設(shè)置λex、λem，按照由稀至濃的次序，測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度，繪制熒光強(qiáng)度—濃度的工作曲線，不改變儀器參數(shù)測定未知溶液的熒光強(qiáng)度，由工作曲線即可求出未知溶液的濃度。

　　F-2700熒光分光光度計(jì)詳細(xì)操作規(guī)程

　　1、開機(jī)

　?。?）開啟計(jì)算機(jī)

　　（2）開啟儀器主機(jī)電源按下儀器主機(jī)左側(cè)面板下方的黑色按鈕（POWER）同時(shí)，觀察主機(jī)正面面板右側(cè)的Xe LAMP 和RUN指示燈依次亮起來，都顯示綠色為正常。

　　（3）雙擊桌面圖標(biāo)（FL Solutions 4.1 for F-7000），主機(jī)自行初始化，掃描界面自動(dòng)進(jìn)入

　　（4）初始化結(jié)束后，須預(yù)熱15-20分鐘，出現(xiàn)操作主界面（界面右下角出現(xiàn)Ready）

　　2、點(diǎn)擊掃描界面右側(cè)“Method”

　　在“General”選項(xiàng)中的“Measurement”選擇“wavelength scan”測量模式 在“Instrument”選項(xiàng)中設(shè)置儀器參數(shù)和掃描參數(shù) 選擇掃描模式“Scan Mode”：Emission/Excitation（發(fā)射光譜/激發(fā)光譜） 選擇數(shù)據(jù)模式“Data Mode”：Fluorescence （熒光測量） 設(shè)定波長掃描范圍

　　掃描熒光激發(fā)光譜（Excitation）：需設(shè)定激發(fā)光的起始/終止波長（EX Start/End WL）和熒光發(fā)射波長（EM WL）

　　掃描熒光發(fā)射光譜（Emission）：需設(shè)定發(fā)射光的起始/終止波長（EM Start/End WL）和熒光激發(fā)波長（EX WL）

　　其他選項(xiàng)可選擇默認(rèn)值（也可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)要求自行設(shè)定） 參數(shù)設(shè)置好后，點(diǎn)擊“確定”

　　3、設(shè)置文件存儲(chǔ)路徑（此步也可不進(jìn)行參數(shù)設(shè)置，可以在按5中方法進(jìn)行保存）

　?。?）點(diǎn)擊掃描界面右側(cè)“Sample”

　?。?）樣品名可自行命名

　?。?）選中“Auto File”，可以自動(dòng)保存原始文件和TXT格式文本文檔數(shù)據(jù)

　?。?）參數(shù)設(shè)置好后，點(diǎn)擊“OK”

　　4、掃描測試

　?。?）打開蓋子，放入待測樣品后，蓋上蓋子（請勿用力）

　?。?）點(diǎn)擊掃描界面右側(cè)“Measure”，窗口在線出現(xiàn)掃描譜圖

　　5、數(shù)據(jù)處理與保存

　?。?）選中自動(dòng)彈出的數(shù)據(jù)窗口

　?。?）右鍵--“Trace”，進(jìn)行讀數(shù)并尋峰等操作

　　（3）“File”--“Save as”對數(shù)據(jù)進(jìn)行保存

　　6、關(guān)機(jī)順序：

　?。?）關(guān)閉運(yùn)行軟件FL Solution 2.1 for F-7000

　?。?）選中“Close the lamp，then close the monitor windows？”點(diǎn)擊“Yes”窗口自動(dòng)關(guān)閉同時(shí)，觀察主機(jī)正面面板右側(cè)的Xe LAMP指示燈暗下來，而RUN指示燈仍顯示綠色

　?。?）約十分鐘后，關(guān)閉儀器主機(jī)電源，即按下儀器主機(jī)左側(cè)面板下方的黑色按鈕（POWER）（目的是僅讓風(fēng)扇工作，使Xe燈室散熱）

　?。?）從樣品池中取出所有比色皿，清洗干凈以便下一次使用

　　（5）關(guān)閉計(jì)算機(jī)

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　　熒光分光光度計(jì)使用注意事項(xiàng)

　　1.在實(shí)驗(yàn)開始前，應(yīng)提前打開儀器預(yù)熱，并配制好所需的溶液，對于已經(jīng)配制好的溶液，在不用時(shí)放在4℃冰箱中保存，放置時(shí)間超過一星期的溶液要重新配制。

　　2.實(shí)驗(yàn)所用的樣品池是四面透光的石英池，拿取的時(shí)候用手指掐住池體的上角部，不能接觸到四個(gè)面，清洗樣品池后應(yīng)用擦鏡紙對其四個(gè)面進(jìn)行輕輕擦拭。

　　3.在測試樣品時(shí)，注意熒光強(qiáng)度范圍的設(shè)定不要太高，以免測得的熒光強(qiáng)度超過儀器的測定上限。

　　4.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，要及時(shí)的清理臺(tái)面，處理廢液，清洗和放置好樣品池，將下次要用的溶液放回冰箱，并且按規(guī)定登記實(shí)驗(yàn)記錄，養(yǎng)成良好的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣。